改良型PRF與普通型PRF在脂肪移植應(yīng)用中的實驗對比研究

柳芳 趙宇 馬莉

[摘要]目的：探索改良型富血小板纖維蛋白（advance platetel-rich fribin，A-PRF）與普通型富血小板纖維蛋白（platetel-rich fribin，PRF）在脂肪移植中的應(yīng)用效果，進而為臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。方法：將18只實驗兔隨機分成三組，實驗組（A-PRF組）：取兔背部脂肪組織，將2ml A-PRF+1ml顆粒脂肪移植到兔耳分離好的區(qū)域;陽性對照組（PRF組）：兔耳移植區(qū)移入2ml PRF+1ml顆粒脂肪;陰性對照組（NS組）：兔耳移植區(qū)移入2ml生理鹽水+1ml顆粒脂肪。分別于4周、8周、12周取材進行大體觀察、稱重、HE染色與免疫染色來比較三組間脂肪成活差異。結(jié)果：各時間點，A-PRF組的脂肪存活率及新生毛細血管密度明顯優(yōu)于其他兩組，PRF組結(jié)果優(yōu)于NS組，且三組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：A-PRF在增加脂肪細胞成活率、減輕炎癥反應(yīng)及促進毛細血管新生方面優(yōu)于普通型PRF，這為A-PRF的臨床使用提供參考。

[關(guān)鍵詞]A-PRF;PRF;顆粒脂肪移植;脂肪細胞成活率;VEGF;細胞因子

[中圖分類號]R622 ? ?[文獻標志碼]A ? ?[文章編號]1008-6455（2019）11-0082-04

Abstract： Objective ?To explore the application of advanced platelet-rich fibrin （A-PRF） and common platelet-rich fibrin （PRF） in fat transplantation in rabbit. Provide guidance for clinical applications. Methods ?Eighteen experimental rabbits were divided into three groups randdomly. The experimental group（A-PRF group）： adipose tissue was taken， and 2ml A-PRF+1ml granule fat was transplanted into the isolated area of rabbit ears. The positive control group（PRF group）： 2ml PRF+1ml granule fat was transferred into the transplantation area. The negative control group（NS group）： 2ml physiological saline +1ml granular fat was transplanted. Gross observation， weighing， HE staining and immunostaining were performed at 4 weeks， 8 weeks， and 12 weeks to compare the survival of fat between the three groups. Results ?At each observation time， the fat survival rate and neonatal capillary density of the A-PRF group were significantly better than the other two groups. The positive control group was superior to the negative control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion ?A-PRF is superior to common PRF in increasing the survival rate of adipocytes， reducing inflammation and promoting capillary angiogenesis， which provides a reference for the use of A-PRF in clinic.

Key words： A-PRF; PRF; granular fat transplantation; adipocyte survival rate; VEGF; cytokines

自體顆粒脂肪移植是整形學(xué)科常規(guī)項目，常用于軟組織缺損修復(fù)，原因如下：①自身脂肪移植避免了移植后的免疫排斥，組織相容性好;②脂肪來源廣泛，供區(qū)提供脂肪的同時可局部塑形;③移植后的脂肪細胞可部分存活，有效地保持了受區(qū)的體積。然而脂肪移植后伴隨而來的壞死、液化、鈣化、囊腫形成等限制了其臨床應(yīng)用。臨床上通過各種方法來提升移植脂肪的存活率，如脂肪干細胞與基質(zhì)血管成分（stromal vascular fraction，SVF）聯(lián)合脂肪細胞移植、各種生長因子及后來的富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）[1]與富血小板纖維蛋白（platetel-rich fribin，PRF）[2]、抗氧化劑添加、促進血管生成藥物使用、獲取過程減少脂肪細胞的損傷、注射方法的改進等。其中PRF是生長因子輔助脂肪細胞移植思路的延續(xù)，PRF是血液離心時引發(fā)內(nèi)源性凝血途徑產(chǎn)生的富血小板纖維蛋白，其內(nèi)富含血小板、細胞因子和炎癥細胞[3-4]，PRF明顯提升脂肪存活率。改良型富血小板纖維蛋白（advance platetel-rich fribin，A-PRF）是低速長時間離心得到的，已有基礎(chǔ)研究提示A-PRF在機械韌度[5]及細胞因子釋放各種方面的優(yōu)越性[6]。本實驗觀察A-PRF、PRF在脂肪移植保存率方面是否有差別，為臨床工作提供思路。

1 ?材料和方法

1.1 研究對象：18只健康新西蘭大白兔，雌雄隨機，體重（3.7±0.2）kg，飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)動物房內(nèi)，飼養(yǎng)條件符合實驗動物要求，實驗征得實驗倫理委員會同意。

1.2 實驗主要儀器：實驗臺，無菌實驗包，骨膜剝離子，注射器，10%水合氯醛，剃毛機，離心機，冰箱。

1.3 實驗方法

1.3.1 PRF與A-PRF制備：麻醉前，采集兔耳中動脈血10ml于無抗凝劑的干管內(nèi)，3 000r/min離心10min制備普通型PRF，2 000r/min離心24min制備A-PRF，均置于零下4℃冰箱內(nèi)冷藏30min備用。

1.3.2 脂肪獲取：麻醉后剃除兔頸背部兔毛，面積約7cm×5cm，俯臥位固定于手術(shù)臺。以兔耳中動脈和耳緣靜脈交界處為a點，耳緣靜脈末端為b點，取ab中點為圓點，1.5cm為半徑畫圓，標記雙耳待剝離區(qū)域。常規(guī)消毒鋪巾，取頸背部正中切口，分離出約5ml脂肪，去除筋膜，剪至1mm3均勻顆粒待用。

1.3.3 分組：將18只新西蘭兔隨機分成3組，陽性對照組（PRF組）：1ml顆粒脂肪+2ml PRF凝膠;陰性對照組（NS組）：1ml顆粒脂肪+2ml生理鹽水;實驗組（A-PRF組）：1ml顆粒脂肪+2ml A-PRF凝膠。

1.3.4 脂肪移植：小型骨膜剝離子沿標記區(qū)域在皮膚與軟骨層間剝離，鑷子取出干管內(nèi)PRF與A-PRF凝膠，小心減去下方的紅色血凝塊，注意保留富血小板纖維蛋白凝膠連接處的紅細胞層。在未去除凝膠內(nèi)水分的情況下（有研究表明細胞因子主要來自于纖維蛋白滲出產(chǎn)物[7]），剪至1mm3均勻顆粒，按照分組將富血小板纖維蛋白與脂肪均勻混合，移植到兔耳剝離區(qū)域內(nèi)，縫合線結(jié)扎關(guān)閉切口（見圖1～3），術(shù)后每只實驗兔以慶大霉素80萬單位連續(xù)肌注3d。

1.4 觀察指標：①大體觀察;②標本重量;③HE染色觀察脂肪細胞成活情況;④免疫組化觀察脂肪內(nèi)新生毛細血管密度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析：運用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行處理。計量資料采用均數(shù)±標準差（x?±s）表示，檢驗方差齊性后，多組均數(shù)間的兩兩比較用SNK-q檢驗，P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 大體觀察：根據(jù)大體觀察及稱重結(jié)果可見：第4周可見A-PRF組重量大于PRF組，NS組脂肪最小;第8周時三組脂肪重量均較第4周有明顯增加，A-PRF組脂肪重量增長最大;12周時脂肪重量較8周有所回落，但仍舊稍高于4周，A-PRF組回落最緩。見表1，圖4～5。

2.2 組織學(xué)觀察：4周同樣顯微倍數(shù)下一個視野內(nèi)A-PRF組脂肪細胞較其他兩組多，且A-PRF組脂肪從大小及排列分布更均勻，相比于其他兩組有更多的炎癥細胞浸潤。同樣，PRF組脂肪切片染色優(yōu)于NS組。8～12周時A-PRF組與PRF組間上述差距減少，但A-PRF組仍舊有較高密度的炎癥細胞浸潤在脂肪細胞周圍，NS組脂肪細胞大小分布不均，且脂肪細胞數(shù)量少，三組間有明顯的纖維生成。見圖6。

2.3 免疫組化結(jié)果：4周時A-PRF組脂肪間免疫染色明顯多于PRF組，A-PRF組可見明顯新生血管形成;8～12周時兩者間未見明顯區(qū)別，但加入A-PRF組的脂肪細胞形態(tài)明顯好于另外兩組。見圖7。

3 ?討論

PRF是血液在離心力作用下促發(fā)內(nèi)源性凝血機制得到的類似于天然纖維蛋白的凝膠狀物質(zhì)，相較于由加入抗凝劑制備而來的PRP相比較，PRF制作工藝簡單，且無需考慮抗凝劑的安全性。PRF具有強大的促增殖能力，尤其是在骨誘導(dǎo)方面，由口腔科引入的PRF在促進脂肪成活方面不如骨誘導(dǎo)效果顯著。A-PRF是2013年新提出的概念，是由更低轉(zhuǎn)速更長時間離心出的血制品。A-PRF結(jié)構(gòu)疏松，細胞及相應(yīng)因子分布不同于普通性PRF，中性粒細胞在A-PRF中分布廣泛。已有相應(yīng)的基礎(chǔ)實驗研究PRF與A-PRF兩者間的生物特性上的區(qū)別，但有關(guān)兩者的動物實驗方面的應(yīng)用很少，本實驗主要研究兩者對于脂肪移植中細胞成活率的區(qū)別。

3.1 脂肪移植：正常脂肪可耐受缺氧極限為24h，而脂肪來源的干細胞耐缺氧的時間可長達72h，脂肪干細胞在脂肪移植后的組織重塑中起關(guān)鍵作用[8]。移植后的脂肪細胞除移植區(qū)域周邊的細胞可通過局部滲透來獲取營養(yǎng)存活，移植中間區(qū)域的細胞則需要新生的毛細血管生成提供營養(yǎng)，而正常新生血管形成需約1周時間。關(guān)于脂肪移植后體積的減少有關(guān)專家認為與移植中脂肪細胞的受損、炎癥聚集導(dǎo)致的細胞凋亡與死亡和移植后脂肪細胞去分化的非壞死性死亡有關(guān)[9]。移植區(qū)域的體積維持原因包括宿主取代與細胞存活兩種因素，宿主取代理論認為移植后脂肪細胞壞死繼而引起宿主巨噬細胞的吞噬，吞噬了脂滴的巨噬細胞轉(zhuǎn)化形成成熟脂肪細胞;細胞存活理論則認為移植后脂肪細胞或干細胞的存活維持了移植后的受區(qū)體積[9]。脂肪細胞在移植后去分化形成不含脂滴的成纖維細胞，該細胞稱為去分化脂肪細胞，去分化脂肪細胞可更好的耐受缺氧，后可再分化為脂肪細胞[9]。無論是有關(guān)脂肪去分化的重塑還是脂肪干細胞的成活都在脂肪移植中占有重要地位。

3.2 PRF：PRF首先應(yīng)用于口腔科，其在骨組織再生方面應(yīng)用廣泛[10]。PRF結(jié)構(gòu)接近天然纖維蛋白，包含有細胞因子、血小板、纖維蛋白相關(guān)聚糖鏈、循環(huán)糖蛋白和纖維蛋白原。PRF中存在雙側(cè)連接和等邊連接，使其具有剛性結(jié)構(gòu)和可移動性，為脂肪細胞增殖遷移做指引。PRF凝塊可緩慢釋放出IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子和IL-4等抗炎因子，還包括血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），其是已知最強大促進血管生長因子[11]。這些細胞因子可有效地減少移植后脂肪存活區(qū)域內(nèi)的炎癥反應(yīng)，同時誘導(dǎo)巨噬細胞等炎癥細胞向移植區(qū)域遷移，穩(wěn)定區(qū)域內(nèi)環(huán)境，VEGF可有效地促進中心區(qū)的新生毛細血管生長，為缺氧的脂肪細胞提供營養(yǎng)。相較于釋放時間短暫的PRP，PRF釋放時間從5～10min開始，持續(xù)60～300min，保證了移植區(qū)內(nèi)長久有效的細胞因子濃度。血液離心后得到產(chǎn)物HE染色由上至下：HE染色：淡黃色清亮的貧細胞層、黃色的凝膠層、紅細胞層。PRF凝膠層電鏡下結(jié)構(gòu)為上部的纖維蛋白，中間的白細胞與下部的紅細胞層[11-12]。而A-PRF在電鏡觀察下發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)上更疏松且纖維蛋白結(jié)構(gòu)空間更大，細胞因子分布更加均勻，包含更高濃度的中性粒細胞。而PRF的促進軟硬組織生長機制似乎正與這種纖維蛋白結(jié)構(gòu)相關(guān)，同樣條件培養(yǎng)PRF與A-PRF使其緩慢釋放細胞因子[3]，ELISA分析發(fā)現(xiàn)A-PRF無論是釋放時間抑或是釋放高峰濃度上都占明顯優(yōu)勢[6]。

A-PRF在輔助兔脂肪細胞移植方面優(yōu)于PRF，可進一步在基礎(chǔ)實驗及臨床上觀察兩者輔助脂肪細胞移植修復(fù)軟組織缺損方面的區(qū)別。本實驗仍有需要改進的方面：①不同年齡與性別的新西蘭實驗兔止凝血功能不同，血小板數(shù)量功能不同，導(dǎo)致采取的離心血液中細胞因子和炎癥細胞纖維蛋白量不同;②PRF凝膠離心后體積較難控制完全一致，具有實驗誤差;③不同觀察時間的移植物中中性粒細胞指標未觀察。

綜上所述，富血小板纖維蛋白可促進實驗兔移植脂肪的存活率，且A-PRF促進脂肪細胞成活作用更明顯，推測其可能與A-PRF三維空間結(jié)構(gòu)、細胞因子濃度及中性粒細胞比例有關(guān)。本實驗有一定的臨床指導(dǎo)意義，有關(guān)于A-PRF與顆粒脂肪的比例以及是否A-PRF在脂肪加工產(chǎn)物如納米脂肪應(yīng)用效果如何，有待進一步實驗研究和探討。

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[收稿日期]2019-04-29

本文引用格式：柳芳，趙宇，馬莉，等.改良型PRF與普通型PRF在脂肪移植應(yīng)用中的實驗對比研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2019，28（11）：82-85.