芹菜葉對自發(fā)性高血壓大鼠內(nèi)皮型一氧化氮合酶及長鏈非編碼RNA-sONE 的影響研究

崔凌志，王子超，唐存亮，黃冠華*

高血壓發(fā)病率高，發(fā)病機制復雜，危害性大，是心血管疾病和全因死亡的重要危險因素［1］。食用鹽過多是引起高血壓的重要因素之一，高鹽飲食會使鹽敏感性高血壓患者血壓明顯增高，而嚴格限制其鹽攝入量后，血壓會隨之下降［2］。芹菜葉既是一種食物，也是一種傳統(tǒng)藥物，具有降血壓作用［3］。然而，其具體降壓機制尚不清楚。有學者報道，芹菜葉的降壓作用與體內(nèi)鈉的降解及長鏈非編碼RNA（LncRNA）-sONE 有關(guān)［4］。LncRNA-sONE 是來源于人內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）相反的DNA 鏈的一個轉(zhuǎn)錄單位（nos3as），干擾抑制eNOS 的增加，而eNOS 基因T-786C 多態(tài)性與鈉的攝入量也有關(guān)［5-6］。eNOS 可催化內(nèi)皮細胞NO 生成，NO 有擴張血管，增加血流量的作用，從而降低血壓［7-9］。因此，本課題組通過購買自發(fā)性高血壓大鼠進行動物實驗研究，旨在探究芹菜葉降血壓的機制。

1 材料與方法

1.1 研究材料 2015 年9 月，購買10 周齡、SPF 級、自發(fā)性高血壓大鼠48 只（雌雄各24 只，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），于溫度21～24 ℃，相對濕度45%～55%，12 h∶12 h 光暗周期下，正常飲食（0.25%的NaCl 飼料）飼養(yǎng)2 周。

1.2 主要試劑及儀器 兔抗鼠eNOS 多克隆抗體，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體，大鼠抗小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體，NO 試劑盒，均購于南京建成科技有限公司。qPCR 法檢測試劑盒購于生工生物工程（上海）股份有限公司。尾動脈無創(chuàng)血壓監(jiān)測儀購于成都泰盟科技有限公司。

1.3 分組 飼養(yǎng)2 周后將大鼠隨機分為高鹽組、正常鹽組和高鹽芹菜葉組，每組16 只（雌雄各半）。高鹽組給予5.00%的NaCl 飼料飼養(yǎng)12 周；正常鹽組給予0.25%的NaCl 飼料飼養(yǎng)12 周；高鹽芹菜葉組先予5.00%的NaCl 飼料飼養(yǎng)8 周后，再予5.00%的NaCl 飼料+10.00%芹菜葉飼養(yǎng)4 周；此外，各組予以足量其他飲食。

1.4 觀察指標

1.4.1 血壓和體質(zhì)量 采用尾袖法和體質(zhì)量刻度測量法，分別測量各組大鼠血壓和體質(zhì)量，2 周/次。

1.4.2 Western blotting 法檢測eNOS 蛋白表達水平 所有大鼠飼養(yǎng)14 周后，腹腔注射氯胺酮麻醉合劑（100 mg/ml；0.1 ml/100 g）后摘除腎臟。分離腎動脈，剔除血管外組織、結(jié)締組織，于-70 ℃冰箱保存。取出凍存腎動脈，在液氮中研磨，置入預冷組織勻漿，冰上裂解。制備蛋白樣品后，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)印，封閉。加入一抗兔抗鼠eNOS 多克隆抗體和二抗羊抗兔抗體孵育。Bio-Rad 凝聚圖像分析軟件分析，將各條帶積分光密度值分別與相應的B-tubulin 條帶積分光密度值比對，以每次電泳的正常鹽組第1 個樣品蛋白條帶的積分光密度值為100%，其余樣品蛋白條帶與之比對，計算積分光密度值的百分比作為eNOS 蛋白表達水平。

1.4.3 qPCR 法 檢 測LncRNA-sONE 和eNOS mRNA 表達水平 將大鼠腎皮質(zhì)制成＜1 mm3切片，切碎的腎組織收集到50 ml 含Ⅱ型膠原酶和中性蛋白酶的離心管中， 37 ℃水浴攪拌30 min，加入DNaseI 后繼續(xù)攪拌30 min。 之后將該管置于冰上，加入預冷細胞勻漿遞質(zhì)5 ml，使懸液完全混合后，采用75 μmol 細胞過濾器進行過濾、離心，F(xiàn)icoll 密度梯度離心法分離遞質(zhì)并收集細胞。之后按照大鼠腎血管內(nèi)皮細胞分離說明書進行操作，直到分離出腎血管內(nèi)皮細胞，Trizol 冷凍保存。按照qPCR試劑盒說明書采用Trizol 試劑從腎血管內(nèi)皮細胞中提取細胞總RNA，引物序列用于LncRNA-sONE 和eNOS mRNA 定量測量。采用2-ΔΔCt法確定特定靶基因RNA的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用成組t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組大鼠不同干預時間體質(zhì)量比較 3 組大鼠干預前、干預4 周體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；3 組大鼠干預8 周、12 周體質(zhì)量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中高鹽組、高鹽芹菜葉組大鼠干預8周、12 周體質(zhì)量均低于正常鹽組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高鹽芹菜葉組和高鹽組干預8 周、12 周體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見表1）。

2.2 3 組大鼠不同干預時間收縮壓比較 3 組大鼠干預前收縮壓比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；3 組大鼠干預4 周、8 周、12 周收縮壓比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中高鹽組、高鹽芹菜葉組大鼠干預4周、8 周、12 周收縮壓高于正常鹽組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高鹽芹菜葉組大鼠干預12 周收縮壓低于高鹽組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高鹽芹菜葉組和高鹽組干預4 周、8 周收縮壓比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見表2）。

2.3 3 組不同性別大鼠干預12 周體質(zhì)量、收縮壓、eNOS 蛋白表達水平、LncRNA-sONE 表達水平、eNOS mRNA 表達水平比較 3 組不同性別大鼠干預12 周體質(zhì)量、收縮壓、eNOS 蛋白表達水平、LncRNA-sONE 表達水平、eNOS mRNA 表達水平比較，差異無統(tǒng)計學差異（P＞0.05，見表3～5）。

表1 3 組大鼠干預不同時間體質(zhì)量比較Table 1 Comparison of body weight of three groups of rats at different intervention weeks

表1 3 組大鼠干預不同時間體質(zhì)量比較Table 1 Comparison of body weight of three groups of rats at different intervention weeks

注：與正常鹽組比較，aP＜0.05

組別 只數(shù) 干預前 干預4 周 干預8 周 干預12 周正常鹽組 16 213.1±4.1 248.9±6.1 304.1±6.0 319.8±6.4高鹽組 16 214.1±4.7 249.3±5.8 302.3±6.4a 314.6±6.5a高鹽芹菜葉組 16 216.6±3.7 245.8±4.1 288.9±24.4a 311.2±13.5a F 值 2.962 2.094 4.894 3.361 P 值 0.062 0.135 0.012 0.044

表2 3 組大鼠干預不同時間收縮壓比較mm Hg）Table 2 Comparison of systolic blood pressure of three groups of rats at different intervention weeks

表2 3 組大鼠干預不同時間收縮壓比較mm Hg）Table 2 Comparison of systolic blood pressure of three groups of rats at different intervention weeks

注：與正常鹽組比較，aP＜0.05；與高鹽組比較，bP＜0.05；1 mm Hg =0.133 kPa

組別 只數(shù) 干預前 干預4 周 干預8 周 干預12 周正常鹽組 16 123±5 134±4 141±5 145±7高鹽組 16 122±5 139±6a 158±9a 168±9a高鹽芹菜葉組 16 120±7 141±6a 157±5a 153±6ab F 值 1.340 6.268 31.147 43.054 P 值 0.272 0.004 ＜0.001 ＜0.001

表3 正常鹽組不同性別大鼠干預12 周體質(zhì)量、收縮壓、eNOS 蛋白、LncRNA-sONE、eNOS mRNA 表達水平比較Table 3 Sex-specific comparison of body weight，systolic blood pressure，and expression levels of eNOS protein，LncRNA-sONE and eNOS mRNA in rats in control group at the 12th week of intervention

表3 正常鹽組不同性別大鼠干預12 周體質(zhì)量、收縮壓、eNOS 蛋白、LncRNA-sONE、eNOS mRNA 表達水平比較Table 3 Sex-specific comparison of body weight，systolic blood pressure，and expression levels of eNOS protein，LncRNA-sONE and eNOS mRNA in rats in control group at the 12th week of intervention

注：eNOS=內(nèi)皮型一氧化氮合酶，LncRNA=長鏈非編碼RNA

性別 只數(shù) 體質(zhì)量（g）收縮壓（mm Hg） eNOS LncRNAsONE eNOS mRNA雄性 8 319.6±6.7 145±7 1.14±0.06 1.03±0.16 1.04±0.17雌性 8 320.0±6.5 146±8 1.15±0.08 1.05±0.04 1.07±0.13 t 值 -0.113 -0.211 -0.260 -0.357 -0.352 P 值 0.911 0.836 0.798 0.727 0.730

表4 高鹽組不同性別大鼠干預12 周體質(zhì)量、收縮壓、eNOS 蛋白、LncRNA-sONE、eNOS mRNA 表達水平比較Table 4 Sex-specific comparison of body weight，systolic blood pressure，and expression levels of eNOS protein，LncRNA-sONE and eNOS mRNA in rats in high salt group at the 12th week of intervention

表4 高鹽組不同性別大鼠干預12 周體質(zhì)量、收縮壓、eNOS 蛋白、LncRNA-sONE、eNOS mRNA 表達水平比較Table 4 Sex-specific comparison of body weight，systolic blood pressure，and expression levels of eNOS protein，LncRNA-sONE and eNOS mRNA in rats in high salt group at the 12th week of intervention

性別 只數(shù) 體質(zhì)量（g）收縮壓（mm Hg） eNOS LncRNAsONE eNOS mRNA雄性 8 314.4±7.6 168±10 0.66±0.08 1.43±0.15 1.62±0.23雌性 8 314.8±5.8 169±9 0.65±0.07 1.46±0.12 1.65±0.16 t 值 -0.111 -0.055 0.066 -0.444 -0.352 P 值 0.913 0.957 0.948 0.664 0.730

2.4 3 組大鼠干預12 周eNOS 蛋白表達水平、LncRNAsONE 表達水平、eNOS mRNA 表達水平比較 3 組大鼠干預12 周eNOS 蛋白表達水平、LncRNA-sONE 表達水平、eNOS mRNA 表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中高鹽組大鼠干預12 周eNOS 蛋白表達水平低于正常鹽組，LncRNA-sONE、eNOS mRNA 表達水平高于正常鹽組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高鹽芹菜葉組大鼠干預12 周eNOS 蛋白、eNOS mRNA表達水平高于正常鹽組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高鹽芹菜葉組與正常鹽組大鼠干預12 周LncRNA-sONE表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；高鹽芹菜葉組大鼠干預12 周eNOS 蛋白、eNOS mRNA 表達水平高于高鹽組，LncRNA-sONE 表達水平低于高鹽組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見表6）。

表5 高鹽芹菜葉組不同性別大鼠干預12 周體質(zhì)量、收縮壓、eNOS蛋白、LncRNA-sONE、eNOS mRNA 表達水平比較Table 5 Sex-specific comparison of body weight，systolic blood pressure，and expression levels of eNOS protein，LncRNA-sONE and eNOS mRNA in rats in high salt celery leaf group at the 12th week of intervention

表5 高鹽芹菜葉組不同性別大鼠干預12 周體質(zhì)量、收縮壓、eNOS蛋白、LncRNA-sONE、eNOS mRNA 表達水平比較Table 5 Sex-specific comparison of body weight，systolic blood pressure，and expression levels of eNOS protein，LncRNA-sONE and eNOS mRNA in rats in high salt celery leaf group at the 12th week of intervention

性別 只數(shù) 體質(zhì)量（g）收縮壓（mm Hg） eNOS LncRNAsONE eNOS mRNA雄性 8 315.2±12.9 152±4 1.41±0.12 1.01±0.15 2.56±0.21雌性 8 307.2±13.3 154±7 1.34±0.07 1.02±0.36 2.55±0.17 t 值 1.200 0.798 1.237 -0.243 0.174 P 值 0.250 0.438 0.237 0.812 0.864

表6 3 組大鼠干預12 周eNOS 蛋白、LncRNA-sONE、eNOS mRNA表達水平比較Table 6 Comparison of the expression levels of eNOS protein，LncRNAsONE and eNOS mRNA in three groups at the 12th week of intervention

表6 3 組大鼠干預12 周eNOS 蛋白、LncRNA-sONE、eNOS mRNA表達水平比較Table 6 Comparison of the expression levels of eNOS protein，LncRNAsONE and eNOS mRNA in three groups at the 12th week of intervention

注：與正常鹽組比較，aP＜0.05；與高鹽組比較，bP＜0.05

組別 只數(shù) eNOS LncRNA-sONE eNOS mRNA正常鹽組 16 1.14±0.07 1.04±0.14 1.05±0.14高鹽組 16 0.65±0.07a 1.45±0.13a 1.63±0.19a高鹽芹菜葉組 16 1.37±0.10ab 1.02±0.14b 2.55±0.18ab F 值 328.713 49.396 301.976 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

高血壓嚴重危害人類健康，其相關(guān)疾病病死率在全球總死亡率中排名第一［1］。高血壓患者中大部分屬鹽敏感性高血壓。鹽敏感性高血壓對氯化鈉的攝入量極為敏感，長期膳食中鈉鹽的攝入量增加，可導致其血壓升高。

本研究中，自發(fā)性高血壓大鼠在第13 周齡被給予高鹽飲食誘導，結(jié)果顯示，高鹽組、高鹽芹菜葉組大鼠干預4 周、8 周、12 周收縮壓高于正常鹽組，高鹽組大鼠干預12 周eNOS 蛋白表達水平低于正常鹽組，LncRNA-sONE、eNOS mRNA 表達水平高于正常鹽組，說明高鹽飲食可誘導大鼠收縮壓增加，LncRNAsONE、eNOS mRNA 表達水平上調(diào)，提示LncRNAsONE 可能參與鹽敏感性高血壓的發(fā)病機制；但eNOS蛋白表達水平下降，也提示eNOS 分泌可能被抑制。而高鹽芹菜葉組大鼠干預12 周收縮壓低于高鹽組；高鹽芹菜葉組大鼠干預12 周eNOS 蛋白、eNOS mRNA 表達水平高于高鹽組，LncRNA-sONE 表達水平低于高鹽組；說明自發(fā)性高血壓大鼠在高鹽飲食的基礎上喂食芹菜葉后，大鼠血壓下降，eNOS 蛋白表達水平上升，LncRNA-sONE 表達下調(diào)；表明芹菜葉能降低鹽敏感性高血壓大鼠的血壓，且LncRNA-sONE、RNA-NOS、eNOS 參加了其降壓機制。

以NO 為代表的血管舒張因子在鹽敏感性高血壓的病理機制中扮演重要角色。研究表明，鹽敏感性高血壓患者血管內(nèi)皮NO 的基礎量分泌不足，且隨著鈉攝入量的增加，一氧化氮合酶（NOS）合成受到抑制，NO 含量降低［10-12］。鈉負荷的增加會降低內(nèi)皮功能，而NOS是NO 合成的唯一限速酶。NOS 廣泛分布于人體內(nèi)，其有3 個同工酶，其中NOS Ⅲ是eNOS 在鹽敏感性高血壓中的重要調(diào)節(jié)器，如強烈抑制eNOS 表達將升高血壓約30 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）［13-14］。但目前eNOS調(diào)控血壓的具體機制尚不清楚［12］。有研究表明，eNOS mRNA 表達水平升高，eNOS 蛋白及NO 含量也會相應升高［15］。近年來，LncRNA 在疾病調(diào)節(jié)中的作用引起關(guān)注，其是一種長度超過200 個核苷酸的RNA 分子，最初其被認為不具有生物學活性；但越來越多的研究表明，LncRNA 可通過調(diào)控細胞的多種生物學活性物質(zhì)，在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的功能［16-17］。LncRNA 可通過染色質(zhì)調(diào)質(zhì)、蛋白質(zhì)變構(gòu)、細胞-細胞信號等多種機制參與血壓的調(diào)節(jié)［3，18］。ZHANG 等［4］研究表明，LncRNA-sONE 參與了鹽敏感性高血壓的發(fā)病機制。

結(jié)合本研究結(jié)果以及上述文獻分析，本課題組推測，芹菜葉降血壓的分子機制可能涉及LncRNA-sONE 表達水平的變化。干預12 周，高鹽組和高鹽芹菜葉組大鼠體質(zhì)量低于正常鹽組，但高鹽芹菜葉組大鼠的體質(zhì)量與高鹽組大鼠無統(tǒng)計學差異，提示每日喂食芹菜葉可降低升高的血壓，但對其體質(zhì)量無影響。由于實驗時舒張壓數(shù)據(jù)的丟失，故未能取得自發(fā)性高血壓大鼠在不同時期的舒張壓結(jié)果，此外由于本研究大鼠只數(shù)較少，結(jié)論尚需進一步驗證。

綜上所述，芹菜葉能升高自發(fā)性高血壓大鼠eNOS蛋白及其mRNA 表達水平，降低LncRNA-sONE 表達水平；同時eNOS、LncRNA-sONE 可能參與了芹菜葉的降壓機制。今后還需進一步擴大樣本量來研究其相關(guān)基因及信號通路情況。

作者貢獻：黃冠華進行文章的構(gòu)思與設計，數(shù)據(jù)收集，論文修訂，負責文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責，監(jiān)督管理；崔凌志負責研究的實施與可行性分析，數(shù)據(jù)整理和論文撰寫；王子超負責統(tǒng)計學處理；唐存亮負責結(jié)果分析與解釋。

本文無利益沖突。