印度梨形孢促進(jìn)棉花幼苗生長及誘導(dǎo)提高苗期抗旱性研究

潘 銳，鄧 晶，胡愛兵，張文英

(1.長江大學(xué)作物抗逆技術(shù)研究中心，湖北 荊州 434025；2.荊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，湖北 荊州 434000)

棉花是世界上最重要的天然纖維作物，陸地棉(GossypiumhirsutumL.)是世界上最重要的棉花栽培種，占全球棉花種植面積的90%以上。中國是世界最大的產(chǎn)棉國，最大的紡織大國和紡織品出口大國，棉花產(chǎn)業(yè)在國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中起很重要的作用。夏季正值棉花的生長期，在降雨量少的新疆棉區(qū)和處于副熱帶高溫高壓覆蓋下的長江中下游棉區(qū)，干旱成為制約棉花產(chǎn)量的因素之一。

印度梨形孢真菌(Piriformosporaindica)可以定殖于植物根部[9]，促進(jìn)植物生長[10]，改善植株形態(tài)[11]，增強(qiáng)植物對氮、磷、硫等礦物質(zhì)的吸收能力，提高植物對生物與非生物逆境的忍耐力[12-14]。前人研究表明，Piriformosporaindica能誘導(dǎo)提高小白菜[15]、大麥[16]、油菜[11]、紫花苜蓿[12]、花生[17]、芝麻[18]、玉米[19]等作物的抗旱性。目前，印度梨形胞對棉花抗旱性效應(yīng)方面的研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)以干旱敏感棉花品種沙洋505-3A為試驗(yàn)材料，通過自然干旱處理和PEG-6000模擬生理干旱，研究接種印度梨形孢對棉花幼苗生長及誘導(dǎo)抗旱性的影響，為提高棉花抗旱性的實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

沙洋505-3A(干旱敏感品種)，由國家棉花中期種質(zhì)庫(河南安陽)提供。印度梨形孢菌種，由德國耶拿大學(xué)Ralf Oelmüller教授提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 種子和真菌預(yù)處理 選取顆粒飽滿，大小一致的棉花種子，用0.5%次氯酸鈉(NaClO)處理10 min，清水沖洗5次后浸泡3 h，播種到育苗盤(96孔)中，生長至3葉1心期；印度梨形孢接種到PDA培養(yǎng)基中生長6～8周，挑選活力充足的菌塊接種到ASP培養(yǎng)基中，放置在溫度為25℃，150 r·min-1的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)10 d備用。

1.2.2 共生體系的構(gòu)建 將印度梨形孢加入無菌水中(1 mg：100 ml)，用攪拌機(jī)打散并混合均勻制成菌液。挑選整齊一致棉花幼苗，移栽至小生長盆(9 cm×13 cm，直徑×高)中，并在幼苗根系注射1ml菌液，共生培養(yǎng)12d后隨機(jī)挑選5株幼苗，蒸餾水沖洗根系泥沙后，剪成1 cm長小段， 10% KOH處理12h，1% HCl浸泡5 min后洗凈，0.04%臺(tái)盼藍(lán)染色制片，顯微鏡(Nikon Ri260)下觀察根系孢子定殖情況。

1.2.3 自然干旱處理 將接菌(P+，下同)和不接菌(P-，下同)的幼苗取出，沖洗干凈移栽至裝有等質(zhì)量已烘干細(xì)沙的生長盆中，每盆4株，每個(gè)處理20盆，各80株苗。每盆澆200 ml的Hoagland營養(yǎng)液后，干旱(D+，下同)處理組不再澆水，非干旱(D-，下同)組正常澆水，處理20 d。試驗(yàn)設(shè)置4次重復(fù)。

1.2.4 PEG干旱處理 將接菌和不接菌的幼苗取出，沖洗干凈后移栽在有孔的泡沫板上，泡沫板置于裝有1.8 L 50% Hoagland溶液的塑料生長盆(28 cm×15 cm×15 cm，長×寬×高)中，每盆4株，每個(gè)處理20盆。空氣泵通空氣緩苗2 d后開始PEG-6000處理，濃度設(shè)置為15%、20%(W/V)，對照組(CK)加等體積蒸餾水，處理24 h。試驗(yàn)設(shè)置4次重復(fù)。

1.3 測定指標(biāo)和方法

1.3.1 形態(tài)指標(biāo) 接種印度梨形孢20 d后，測量棉花株高、莖粗、葉面積；用WinRHIZO根系分析系統(tǒng)測量植株根系參數(shù)(下同)；將地上部分和地下部分分離，稱量鮮重后105℃殺青，75℃烘干至恒重測量干重。自然干旱處理7d后采集照片，測量株高、莖粗、根系參數(shù)。PEG脅迫處理48 h后采集照片。

1.3.2 葉片光合作用參數(shù) 接種印度梨形孢20 d后采用LI-6400光合作用儀(LI-COR)，LED內(nèi)置紅藍(lán)光源，光強(qiáng)800 μmol·m-2·s-1測量凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導(dǎo)度(Gs)。

1.3.3 葉片溫度 干旱處理7 d后用紅外熱成像(IRBIS plus 3)儀采集葉片溫度。PEG脅迫下用紅外熱成像儀從0～24 h每1 h采集一次熱紅外圖像。

1.3.4 葉片光譜反射率 干旱處理7 d后用FieldSpec 4 Wide-Res Field Spectroradiometer便攜式地物光譜儀測量倒三葉葉片的光譜，測量范圍為350～2 500 nm，光譜間隔3 nm@700 nm，每個(gè)葉片讀取3次數(shù)據(jù)。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010處理和作圖，DPS 9.05數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 印度梨形孢在棉花幼苗根系定殖

共生12 d后，棉花植株根系鏡檢圖片(圖1)可以看到：印度梨形孢的厚垣孢子成串排列于根系內(nèi)，且分布密集，數(shù)量多。印度梨形孢成串排列是其進(jìn)入植株根內(nèi)的典型特征，表明印度梨形孢成功進(jìn)入棉花根系內(nèi)并有效定殖。

2.2 印度梨形孢對棉花幼苗生長的影響

棉花幼苗接種印度梨形孢共生生長20 d后，調(diào)查其生長狀況(圖2)，分析可知：接菌植株(P+，下同)對比不接菌植株(P-，下同)，株高、莖粗、葉面積分別增加了32.4%、15.8%和20.5%，均達(dá)到顯著水平(P<0.05，下同)。表明接種印度梨形孢可以促進(jìn)棉花幼苗生長。

沙洋505-3A接種印度梨形孢共生20 d后掃描根系生長參數(shù)(表1)，分析可知：接種印度梨形孢后，總根長、根總表面積、根體積和根尖數(shù)分別增加了23.9%、9.2%、35.6%和62.5%，均達(dá)到顯著水平。表明接種印度梨形孢后，促進(jìn)了沙洋505-3A根系的生長，根系形態(tài)發(fā)生改變，側(cè)根數(shù)量顯著增加。

圖1 印度梨形孢在棉花幼苗根部的定殖Fig.1 Colonization of Piriformospora indicaon the root of cotton

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。Note: Different lowercase letters indicate significate difference (P<0.05), the same below.圖2 接種印度梨形孢20 d的棉花幼苗生長狀況Fig.2. Piriformospora indica affected morphological growth on cotton seedling after 20 d of treatment

處理Treatment總根長Total rootlength/cm根總表面積Total root surface area/cm 2根體積Root volume/cm 3根尖數(shù)Root tip numberP+218.76±11.059a14.14±0.395a0.301±0.017a498.32±45.886aP-176.62±9.824b12.95±0.260b0.222±0.012b306.60±24.000b

注: 同列不同小寫字母表示顯著性差異(p<0.05), 下同.

Notes: Different lowercase letters in same column indicate significant difference (p<0.05). The same below.

沙洋505-3A接種印度梨形孢20 d后生物量測定(表2)分析可知：接種印度梨形孢后沙洋505-3A地上部分鮮重和干重分別增加了27.7%和39.2%，地下部分鮮重和干重分別增加了20.3%和20.7%，均達(dá)到顯著差異。表明印度梨形孢定殖于棉花根系內(nèi)顯著促進(jìn)棉花地上部分和地下部分干物質(zhì)的累積。

2.3 印度梨形孢對棉花幼苗光合作用的影響

對接種印度梨形孢20 d后棉花幼苗的光合作用參數(shù)(圖3)分析可知：接種印度梨形孢棉花植株對比未接菌的植株凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度、蒸騰速率分別提高了29.1%、55.9%、20.1%和51.1%。表明接種印度梨形孢增強(qiáng)了沙洋505-3A的光合作用。其中，氣孔導(dǎo)度增加最為顯著，繼而引起胞間CO2濃度上升，凈光合作用增加。

2.4 印度梨形孢誘導(dǎo)提高棉花的抗旱性

2.4.1 干旱脅迫下印度梨形孢對棉花地上部形態(tài)的影響 調(diào)查接種印度梨形孢對沙洋505-3A抗旱性的影響，由圖4可以看到：P+D-(接菌，不干旱，下同)和P-D-(未接菌，不干旱)對比，接菌棉花植株的株高、真葉數(shù)目、葉面積等明顯大于不接菌植株，促生作用顯著；P+D+(接菌，干旱)和P-D+(未接菌，干旱)對比，接菌的植株干旱處理7 d后其葉片卷曲和萎蔫下垂程度明顯比未接菌的植株減輕。測量棉花植株的株高和莖粗(圖5)，分析可知：干旱脅迫7 d后，未接菌植株株高和莖粗分別降低23.3%和8.7%；接菌植株株高和莖粗分別降低14.1%和5.3%。說明接種印度梨形孢降低了干旱脅迫對棉花植株生長的抑制效應(yīng)，誘導(dǎo)提高了棉花的抗旱性。

2.4.2 干旱脅迫下印度梨形孢對棉花根系形態(tài)的影響 調(diào)查接種印度梨形孢干旱處理7 d后根系性狀(圖6)，從根系掃描圖分析可知：對比P+D-和P+D+，接菌植株在干旱條件下側(cè)根數(shù)量顯著增加，根長變化不明顯；對比P-D-和P-D+，不接菌植株在干旱條件下側(cè)根數(shù)量變化不明顯，但根長顯著增加。從分析得到的根系指標(biāo)(表3)可知：干旱7 d后，接菌植株總根長、總根表面積、根體積、根尖數(shù)分別增加了9.6%、9.9%、3.8%和21.3%；不接菌植株總根長、總根表面積、根體積分別增加了11%、27.7%、12.2%，根尖數(shù)降低5.2%。這表明接種印度梨形孢植株在干旱條件下，主要是通過增加側(cè)根數(shù)量來響應(yīng)逆境；未接菌植株在干旱條件下，主要的根系形態(tài)變化是根長和表面積顯著增加。二者在根系形態(tài)結(jié)構(gòu)上存在顯著差異。

表2 接種印度梨形孢20 d后棉花植株地上部、地下部干鮮重

圖3 接種印度梨形孢20 d后的棉花幼苗光合作用參數(shù)Fig.3 Photosynthetic parameters of cotton seedling inoculated with Piriformospora indica for 20 days

2.4.3 干旱脅迫下印度梨形孢對棉花葉溫的影響 熱紅外圖像中提取葉溫(圖7)，干旱處理前，接種印度梨形孢植株葉片溫度高于未接菌植株。干旱處理7 d后，未接菌植株葉片平均溫度上升0.97℃；接菌植株葉片平均溫度上升0.34℃。這表明接種印度梨形孢減緩了干旱條件下棉花葉片溫度的上升，在一定程度上維持了葉片的正常生長代謝。

2.4.4 干旱脅迫下印度梨形孢對棉花葉片光譜反射率的影響 分析葉片的光譜反射率圖像可知：350～780 nm為色素相關(guān)波段(圖8a)，光譜曲線在400～480 nm和650～720 nm兩個(gè)波段各有1個(gè)由于色素強(qiáng)烈吸收產(chǎn)生的波谷，干旱脅迫后接菌和不接菌植株波谷反射率均升高，且不接菌植株升高更顯著。這說明干旱脅迫后，植株葉片吸收光能降低，且不接菌植株比接菌植株降低更顯著；在1 350～1 480 nm和1 820～2 000 nm兩個(gè)波段各有一個(gè)隨含水量升高而降低的波谷(圖8b)，干旱脅迫后接菌和不接菌植株波谷反射率均升高，且不接菌植株升高更顯著。說明干旱脅迫后，植株葉片含水量降低，且接種印度梨形孢減緩了棉花植株葉片含水量的降低。

注：P+D-: 接菌不干旱；P-D-: 不接菌不干旱；P+D+: 接菌干旱；P-D+：不接菌干旱。Note：P+D- means inoculated with Piriformospora indica and without drought treatment; P-D-means non-inoculated with Piriformospora indica and without drought treatment; P+D+ means inculated with Piriformospora indica and with drought treatment; P-D+ means non-inoculated with Piriformospora indica and with drought treatment.圖4 干旱脅迫和接種印度梨形孢對棉花幼苗植株形態(tài)的影響Fig.4. Morphological characters of cotton seedlings inoculated with Piriformospora indica or drought stress

圖5 干旱脅迫和接種印度梨形孢對棉花幼苗株高、莖粗的影響Fig.5 Plant height and stem diameter of cotton seedlings inoculated with Piriformospora indica or drought stress

圖6 各處理棉花幼苗根系掃描圖Fig.6 The scanning picture of root system of cotton seedlings under different treatments

處理Treatment總根長Total root length/cm總根表面積Total root surface area/cm2根體積Root volume/cm3根尖數(shù)Root tip numberP+D-262.7±17.406b18.1±0.368b1.823±0.047a325.1±33.6bP+D+287.8±6.861a19.9±0.441a1.884±0.275a394.3±32.5aP-D-234.1±30.020c13.0±0.260c1.221±0.012c306.6±24.0cP-D+259.9±5.642b16.6±0.580b1.370±0.041b290.8±32.1c

圖7 干旱處理0、7 d接菌和不接菌植株紅外圖像和葉片溫度Fig.7 The thermography image and leaf temperature of cotton plants inoculated withPiriformospora indica under drought treatment for 0 and 7 days

圖8 各處理棉花葉片色素(a)和水分(b)相關(guān)波段反射率Fig.8 Reflectance of leaf pigments and water related bands of cotton plants inoculated withPiriformospora indica under drought stress for 7 days

2.4.5 干旱脅迫下印度梨形孢對棉花MDA含量的影響 由接種印度梨形孢干旱處理7 d后MDA含量(圖9)分析可知：干旱處理7 d后接種和不接種印度梨形孢植株分別與P+D-和P-D-2個(gè)處理相比MDA含量上升9.9%和19.1%，且不接菌植株達(dá)到顯著水平(P<0.05)，接菌植株不顯著。這說明：接種印度梨形孢可以緩解干旱脅迫下棉花植株產(chǎn)生MDA。

2.4.6 PEG脅迫下印度梨形孢對棉花形態(tài)的影響 PEG脅迫48 h后植株形態(tài)(圖10a)可以看出：接種和不接種印度梨形孢植株在15%PEG脅迫下均出現(xiàn)葉片失水萎蔫下垂，且未接種印度梨形孢植株葉片下垂更顯著；20%PEG脅迫后接種和不接種印度梨形孢植株葉片失水比15%PEG脅迫下更顯著，且不接菌植株出現(xiàn)莖稈倒伏的現(xiàn)象。葉片形態(tài)圖(圖10b)可以看出：接菌植株葉片在15%和20%PEG脅迫下卷曲程度和萎蔫程度均較未接菌植株減輕。這說明15%和20%PEG脅迫下，接種印度梨形孢減緩了對植株形態(tài)學(xué)的影響，維持了植株生長。

圖9 干旱脅迫7 d后各處理MDA含量Fig.9 MDA content of cotton plants inoculated withPiriformospora indica under drought stress for 7 days

注：從左至右依次為：P+CK, P+15%PEG, P+20%PEG, P-CK, P-15%PEG, P-20%PEG。Note: From left side to right side in order:P+CK, P+15%PEG,P+20%PEG,P-CK, P-15%PEG, P-20%PEG.圖10 PEG脅迫48 h后接菌和不接菌植株(a)和倒三葉葉片形態(tài)(b)對比Fig.10 Plant morphology of whole plant (a), backward third leaf (b) of cotton inoculated withPiriformospora indica under PEG induced drought stress for 48 h

2.4.7 PEG脅迫下印度梨形孢對棉花葉溫的影響 記錄接種和不接種印度梨形孢棉花植株遭受不同濃度PEG脅迫后的實(shí)時(shí)溫度(圖11)，分析可知：接種和不接種印度梨形孢棉花植株在0、15%、20%PEG脅迫下葉片實(shí)時(shí)溫度逐漸升高；接菌植株在0、15%、20%PEG脅迫下葉溫均低于未接菌植株；未接菌植株在15%和20%PEG脅迫下葉溫上升幅度大于未接菌植株。這說明隨著PEG濃度的升高，葉片葉溫逐漸升高，接種印度梨形孢減緩了棉花植株在PEG脅迫下葉溫的升高，維持葉片的正常生長。

圖11 不同濃度PEG脅迫下印度梨形孢對棉花葉片溫度變化的影響Fig.11 Real time leaf temperature of cotton plants inoculated with Piriformospora indica under different concentrations of PEG stress

3 討 論

1)光合作用是植物生長過程中固定能量的主要途徑[20]。棉花幼苗接種印度梨形孢后，氣孔導(dǎo)度增加進(jìn)而增加了葉片的胞間CO2濃度，凈光合作用速率上升，干物質(zhì)累積加快，體現(xiàn)在作物表型上即株高、莖粗、葉面積等顯著增加。這與印度梨形孢促進(jìn)油菜[11]、芝麻[18]、玉米[21]、水稻[10]等作物生長的研究結(jié)果一致。

2)植物遭受非生物脅迫后會(huì)通過植株表型的可塑性來適應(yīng)逆境[22-25]，干旱脅迫下最主要的應(yīng)激性反應(yīng)體現(xiàn)在作物根系上[26-27]。未接菌植株干旱條件下根系根長增加明顯，側(cè)根數(shù)量無明顯增加；接菌植株干旱條件下側(cè)根大量增加，總根長顯著增加。相較而言，通過增加側(cè)根的方式增大根表面積和體積具有較多優(yōu)勢：側(cè)根數(shù)量越多，根系在土壤中覆蓋面積越廣，水分來源越豐富；增加側(cè)根數(shù)量比延長根長吸收水分時(shí)運(yùn)輸路徑短、速度快；長時(shí)間干旱時(shí)根系細(xì)胞凋亡，根系過長易脫落[26]。發(fā)達(dá)的根系能促進(jìn)植物生長并提高其抗逆性[28]。接種印度梨形孢后總根長、根表面積、根體積、根尖數(shù)增加，有利于植株吸收水分和營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)生長，這可能也是接菌植株具有更強(qiáng)抗旱性的一個(gè)因素。

3)棉花遭受干旱脅迫后，植株體內(nèi)水平衡失調(diào)[29]，細(xì)胞內(nèi)水勢降低[30]，葉片萎蔫下垂，自然干旱和PEG生理干旱結(jié)果一致。水分是植株體內(nèi)多種代謝反應(yīng)的必要條件，對植株的正常生長意義重大[29]。接種印度梨形孢植株在干旱條件下能減緩葉片失水，保持葉片外部正常形態(tài)和內(nèi)部正常代謝反應(yīng)，這一點(diǎn)與光譜參數(shù)中水分相關(guān)波段結(jié)果一致。葉片是植物光合作用、蒸騰作用等重要生理代謝反應(yīng)的場所，葉片的降溫能力與作物的抗逆性高度相關(guān)[31]。葉溫不僅與環(huán)境相關(guān)，也受葉片輻射吸收率、氣孔、葉偏轉(zhuǎn)角、水分分布等因素影響[32]。葉片降溫的主要方式為蒸騰作用，但此過程需要大量的水分。在干旱條件下，葉片水分減少引發(fā)氣孔關(guān)閉，葉溫上升[31]。接種印度梨形孢葉片本身的氣孔導(dǎo)度升高，并且能維持較高的葉片含水量，具有良好的降溫方式。在15%和20%PEG生理干旱脅迫下，脅迫0～24 h之間，接種印度梨形孢植株的葉溫始終維持在低于未接種植株水平。接種印度梨形孢有助于維持葉片的水分平衡和溫度穩(wěn)定，保持正常的生理代謝，是誘導(dǎo)提高棉花抗旱性的重要途徑。

4)MDA是植物細(xì)胞膜過氧化作用的產(chǎn)物之一，是評價(jià)植物細(xì)胞膜損傷的重要因素[6-7]。。前人的研究均表明，接種印度梨形孢能顯著提高植株體內(nèi)SOD、POD、CAT等多種氧化保護(hù)酶的活性，增強(qiáng)植株的清除活性氧的能力，減緩MDA的累積。本試驗(yàn)中，接種印度梨形孢植株干旱脅迫后MDA含量顯著低于不接菌植株。這表明減緩細(xì)胞膜在干旱條件下的損傷，是印度梨形孢誘導(dǎo)提高棉花抗旱性的另一個(gè)因素。

5)接種印度梨形孢的棉花植株在形態(tài)指標(biāo)上表現(xiàn)出抗旱性的增強(qiáng)，其分子調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。惠非瓊等[33]研究表明，干旱脅迫下，接種印度梨形孢的煙草植株干旱相關(guān)蛋白基因RD29A、ERD1、ERD10A、SDIR表達(dá)量均顯著上調(diào)。孫超等[34]的研究結(jié)果也表明，接種印度梨形孢能顯著提高小白菜中干旱相關(guān)蛋白CBLl和RD29A的表達(dá)量，進(jìn)而提高小白菜的抗旱性。因此，印度梨形孢可能是通過調(diào)控干旱相關(guān)基因表達(dá)量來誘導(dǎo)提高作物抗旱性的。但是在棉花中，這一機(jī)制尚不清楚，這將是下一步研究的方向。

4 結(jié) 論

1)接種印度梨形孢，可顯著提高棉花幼苗凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度、蒸騰速率，從而使棉花株高、莖粗和葉面積顯著增加，促進(jìn)棉花幼苗生長。

2)在干旱條件下，接種印度梨形孢可以促進(jìn)棉花根系生長，顯著增加棉花幼苗根尖數(shù)，提高棉花幼苗的抗旱性。

3)接種印度梨形孢可以維持葉片在干旱環(huán)境下正常的葉溫，降低處理前后棉花幼苗的葉溫差，保持幼苗葉片的色素含量和含水量，維持正常的生理代謝，提高棉花苗期的抗旱性。

4)接種印度梨形孢可以提高棉花幼苗在干旱環(huán)境下清除丙二醛(MDA)的能力，降低對植物細(xì)胞的損傷，從而提高棉花苗期的抗旱性。

綜上所述，接種印度梨形孢通過增強(qiáng)光合作用和促使根系根系伸長、增粗、增加側(cè)生根數(shù)量促進(jìn)棉花生長，并且通過維持葉片水分和葉片溫度保持葉片正常代謝，改變根系結(jié)構(gòu)來誘導(dǎo)提高棉花的抗旱性，對干旱地區(qū)棉花的抗旱性研究具有重要意義。