崗梅清瘟敗毒合劑的提取工藝優(yōu)化及薄層色譜鑒別方法▲

金雪峰 劉 元 陳 英

(1 廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，南寧市 530021，電子郵箱：jinxuefeng_521111@126.com；2 廣西中醫(yī)藥研究院，南寧市 530022)

手足口病是由多種腸道病毒引起的傳染性疾病，以嬰幼兒發(fā)病為主。該病以發(fā)熱和手、足、口腔等部位出現(xiàn)皮疹或皰疹為主要特征，屬自限性疾病，嚴(yán)重威脅人類尤其是兒童的健康[1-2]。引起手足口病的腸道病毒主要包括新型腸道病毒71型和A組柯薩奇病毒等[3-4]。對于該疾病的治療，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要以抗病毒、預(yù)防感染為主，尚無特效藥物和疫苗。因此，研發(fā)一種能夠快速緩解病情、特異性有效治療手足口病的新型藥物制劑，是一個亟待解決的國際性難題。

壯醫(yī)理論提出人體因毒發(fā)病，因氣虛受有形無形之毒侵犯，應(yīng)以調(diào)氣、解毒、補(bǔ)虛為原則，采用藥物解毒功效以達(dá)治療目的[5]。崗梅清瘟敗毒合劑是廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院根據(jù)廣西地方民族經(jīng)驗方，經(jīng)篩選后研制的中藥民族藥制劑，主要由生石膏、麻黃、山芝麻、梅葉冬青、黃芩、貫眾、杏仁、桔梗、柴胡等組成，具有清熱宣肺、透疹生津之功效，用于證屬風(fēng)溫邪在肺衛(wèi)證及風(fēng)溫邪熱壅盛證的手足口病，亦可用于感冒證屬風(fēng)熱證者。本文通過正交實驗法確定其最佳提取工藝，此外采用薄層色譜法定性鑒別了處方中的黃芩、粉葛、柴胡，旨在控制本品質(zhì)量、確保其療效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 YOKO-ZS紫外分析攝影儀、YOKO-BD薄層電動點(diǎn)樣儀均購自武漢藥科新技術(shù)開發(fā)公司，LC3000I型高效液相色譜儀、UV3000紫外檢測器、CXTH-3000色譜工作站購自北京創(chuàng)新通恒科技有限公司。

1.2 試藥 乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余所用試劑均為分析純。麻黃堿對照品(中國藥品生物制品檢定研究院提供，供含量測定用，批號：110737-201516)。黃芩苷對照品(批號：111754-200601)、葛根素對照品(批號：110756-200110)、柴胡對照藥材(批號：121465-200501)均購自中國藥品生物制品檢定所。崗梅清瘟敗毒合劑由廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院提供(批號：180729、180730、180731)。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取工藝優(yōu)化

2.1.1 因素水平的確定：選取藥材浸泡時間(A)、提取溶劑量(B)、提取次數(shù)(C)、提取時間(D)作為水提的主要影響因素。設(shè)定藥材浸泡時間為0 h、0.5 h、1.0 h 3個水平，提取溶劑量為加水量的8/6/6倍、10/8/8倍、12/10/10倍3個水平，提取次數(shù)為1次、2次、3次3個水平，提取時間為1 h、1.5 h、2 h 3個水平。采用L9(34)正交試驗表安排正交試驗，因素水平見表1。

表1 水提工藝條件正交試驗因素水平表

2.1.2 提取方法：根據(jù)工藝要求，稱取1/2個處方量藥材9份，每份藥材含石膏30 g、麻黃7.5 g、黃芩7.5 g、山芝麻10 g、崗梅根10 g、貫眾10 g、杏仁7.5 g、桔梗10 g、柴胡12.5 g、蘆根10 g、粉葛20 g、薏苡仁20 g、蒼術(shù)10 g、淡竹葉7.5 g、炙甘草6 g(均購自南寧生源中藥飲片有限責(zé)任公司)；分別根據(jù)L9(34)正交表(見表2)內(nèi)的9個試驗列號及條件進(jìn)行，將每次試驗的提取液濾過，合并濾液，濾液濃縮至500 mL，靜置24 h，濾過，加入用適量熱水煮沸溶解的羥苯乙酯0.3 g，加水調(diào)整總量至500 mL，備用。

2.1.3 麻黃堿含量的測定：精密稱取麻黃堿對照品適量，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得對照品溶液。取合劑5 mL，置具塞錐形量瓶中，精密加入稀乙醇20 mL，稱定重量，超聲處理1 h(200 W，40 kHz)，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足缺失重量，搖勻，濾過，即得供試品溶液。分別吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μL進(jìn)樣，按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則[6]，測定每個實驗樣品提取所得麻黃堿的含量，結(jié)果見表2～3。

表2 L9(34)正交試驗方案及結(jié)果

表3 正交試驗方差分析結(jié)果

2.1.4 測定結(jié)果及提取條件的確定：各因素R值大小為C>D>B>A，由此可知，因素C是影響提取工藝的重要因素，因素B、D是次要因素，因素A是更次要的因素。再結(jié)合各因素K值進(jìn)行分析，確定提取的最佳工藝條件為A1B1C2D2：(1)浸泡時間(A)，三者K值相差不大，為節(jié)省時間，故定浸泡時間為0 h；(2)提取溶劑量(B)，8/6/6倍的K值最高，且節(jié)省溶劑，故定提取溶劑量為加水量的8/6/6倍；(3)提取次數(shù)(C)，盡管提取3次的K值最高，但與提取2次相差不大，為節(jié)省時間、溶劑，大生產(chǎn)可不予以考慮，故定提取次數(shù)為2次；(4)提取時間(D)，提取2 h的K值最高，但與1～5 h獲得總量基本一致，故定提取時間為1.5 h。

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1黃芩的鑒別：取2.1.2中制備的崗梅清瘟敗毒合劑30 mL，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1～2，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液(水溶液備用)，蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。另取黃芩苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部中有關(guān)薄層色譜法的步驟[6]進(jìn)行試驗，吸取供試品溶液3～5 μL，對照藥材溶液3～5 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸(4 ∶1 ∶10)為展開劑展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液,105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾，見圖1。

圖1 黃芩苷薄層色譜圖

注：1為崗梅清瘟敗毒合劑180729供試品；2為崗梅清瘟敗毒合劑180730供試品；3為黃芩苷對照品；4為缺黃芩陰性對照；5為崗梅清瘟敗毒合劑180731供試品。

2.2.2 柴胡的鑒別：取2.1.2中制備的崗梅清瘟敗毒合劑30 mL，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次25 mL，棄去乙酸乙酯液；水液用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次25 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次25 mL，棄去洗滌液；蒸干正丁醇液，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。另取柴胡對照藥材0.5 g，加適量水煮沸1 h，濾過，濾液濃縮至15 mL，水液用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次25 mL，其余步驟同供試品溶液的制備方法，即得對照藥材溶液。按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部中有關(guān)薄層色譜法的步驟[6]進(jìn)行試驗,吸取上述兩種溶液各3～5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(8 ∶2.5 ∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干。噴以2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，在60℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰,日光下檢視。在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾，見圖2。

圖2 柴胡薄層色譜圖

注：1為崗梅清瘟敗毒合劑180729供試品；2為崗梅清瘟敗毒合劑180730供試品；3為柴胡對照藥材；4為缺柴胡陰性對照；5為崗梅清瘟敗毒合劑180731供試品。

2.2.3 粉葛的鑒別：取2.2.1 中用于鑒別黃芩的備用水溶液，用氨試液調(diào)至中性,用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次25 mL；合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL溶解，作為供試品溶液。另取葛根素對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。按照《中華人民共和國藥典》2015年版四部中有關(guān)薄層色譜法的步驟[6]進(jìn)行試驗,吸取上述兩種溶液各3～5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(8 ∶2.5 ∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干。置氨蒸氣中熏后，紫外燈365 nm下檢視。在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無干擾，見圖3。

圖3 葛根薄層色譜圖

注：1為崗梅清瘟敗毒合劑180729供試品；2為崗梅清瘟敗毒合劑180730供試品；3為葛根素對照品；4為缺粉葛陰性對照；5為崗梅清瘟敗毒合劑180731供試品。

3 討 論

手足口病作為危害人類健康的重要傳染疾病，目前尚無特效治療藥物。中醫(yī)藥或可通過綜合治療效應(yīng)，對手足口病的防治發(fā)揮積極作用。祖國中醫(yī)認(rèn)為手足口病是由于外感時邪疫毒，內(nèi)傷濕熱蘊(yùn)結(jié)，衛(wèi)表被遏，肺氣失宣，心脾積熱所致；主要病位在肺、脾、心三臟，嚴(yán)重可累及心包經(jīng)和肝經(jīng)，同時存在衛(wèi)氣營血轉(zhuǎn)變[7]。中醫(yī)醫(yī)治本病以清熱利濕透疹為主要治療原則，辛涼解表、清熱、除濕、解毒、理脾助運(yùn)兼以清化，采用辨證施治、分期論治等方法，可取得比較良好的療效[8-9]。崗梅清瘟敗毒合劑所包含的麻黃、柴胡具有發(fā)汗解表、宣肺平喘等功效[10-11]，黃芩、梅葉冬青、山芝麻等能夠清熱瀉火、解毒涼血[12-13]，葛根、竹葉等能夠疏風(fēng)散熱、生津開郁[14]，與壯醫(yī)理論治療疾病的基本原則相一致。利用正交實驗設(shè)計，我們篩選出了崗梅清瘟敗毒合劑的最佳制備工藝，具體條件為藥材浸泡0 h，提取溶劑量為加水量的8/6/6倍，提取次數(shù)為2次，提取時間為1.5 h。這既節(jié)省了實驗時間及實驗試劑，又具有較高的提取效率，工藝穩(wěn)定，適合大工業(yè)生產(chǎn)。

對于中藥復(fù)方制劑的鑒別，應(yīng)根據(jù)其特點(diǎn)，尋找簡便、快速并具有較強(qiáng)專屬性的方法，才能起到有效控制質(zhì)量的目的[15]。為了更好地控制崗梅清瘟敗毒合劑藥品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究制定了黃芩、粉葛、柴胡的薄層色譜鑒別方法。對于柴胡的鑒別，在提取供試品時，我們發(fā)現(xiàn)先用乙酸乙酯振搖提取并棄去乙酸乙酯液，再用水飽和的正丁醇振搖提取，色譜帶清晰；在選擇展開劑試驗中，經(jīng)比較三氯甲烷-甲醇-水(6.5 ∶3 ∶0.5)、三氯甲烷-甲醇-水(8 ∶2.5 ∶0.2)的層析效果，我們發(fā)現(xiàn)以前者作為展開劑時，展開劑極性太大，斑點(diǎn)Rf值過高，以后者為展開劑時，斑點(diǎn)Rf值最佳，分離效果最佳，故最終選擇三氯甲烷-甲醇-水(8 ∶2.5 ∶0.2)作為展開劑。在鑒別粉葛時，我們發(fā)現(xiàn)用鹽酸酸化樣品后，用乙酸乙酯振搖提取后的水溶液，再用水飽和的正丁醇振搖提取，樣品斑點(diǎn)無雜質(zhì)干擾。鑒別柴胡時，我們采用三氯甲烷-甲醇-水(8 ∶2.5 ∶0.2)作為展開劑，斑點(diǎn)Rf值合適。黃芩、粉葛、柴胡的薄層色譜鑒別結(jié)果顯示陰性無干擾，提示合劑的薄層色譜鑒別方法可行，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性良好，這有利于更好地控制崗梅清瘟敗毒合劑的制劑質(zhì)量。