人HSPA8基因生物信息學分析及亞細胞定位

吳小敏 趙佳福 倪鍇 朱曉峰 許厚強

（1. 貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室 貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴陽 550025；2. 貴州大學動物科學學院，貴陽 550025）

熱休克蛋白（Heatshock protein，HSP）是生物體在不良因素作用下產(chǎn)生的一組特殊應激蛋白［1］，在分子伴侶活動、細胞分裂、信號傳導及轉(zhuǎn)錄和翻譯等過程具有調(diào)控作用［2］。此外，HSP還參與腫瘤及病毒感染調(diào)控［3］，在疾病的發(fā)生中扮演重要角色。HSP70作為HSP家族的主要成員之一，是生物體中普遍存在一種高度保守的蛋白［4-5］，由于其應激反應最為敏感，以及在醫(yī)學臨床中發(fā)揮的重要作用［6］使得HSP70成為HSP家族中研究最為深入的一種。大量研究表明，HSP70可通過介入信號轉(zhuǎn)導通路來影響機體功能。如TGF-β信號在腫瘤發(fā)生早期具有抑制細胞增生的作用，過表達HSP70后對TGF-β信號通路有著明顯的抑制作用［7］。除此之外，HSP70家族可以作為細胞應激的強效緩沖系統(tǒng)，使得腫瘤細胞很大程度上依賴這一緩沖系統(tǒng)生存［8］。HSPA8屬于HSP70家族組成型表達的同源蛋白［9］，是該家族的主要管家蛋白質(zhì)，占細胞總蛋白質(zhì)含量的1%［10］，正常情況下低表達或不表達，應激狀態(tài)下細胞內(nèi)HSP編碼基因被激活進行表達［11］，參與細胞內(nèi)蛋白的正確折疊、移位及降解等過程［12-13］，維持細胞的正常形態(tài)及功能，保證細胞的穩(wěn)定性。目前關(guān)于HSPA8基因及其表達產(chǎn)物在機體發(fā)展過程中的作用機制尚不完全清楚，需進一步深入研究。本研究通過克隆人HSPA8基因CDS區(qū)，運用在線軟件對HSPA8基因序列進行生物信息學分析，構(gòu)建pEGFP-C1-HSPA8重組真核表達載體，轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞，觀察其亞細胞定位情況，旨在為進一步研究HSPA8的胞內(nèi)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體及細胞 pMD-19-T載體、pEGFPC1載體分別購自TaKaRa公司和BioVector公司；JM109感受態(tài)細胞、人前列腺癌細胞和HEK-293T細胞由貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室保存。

1.1.2 試劑與儀器 Trizol Reagent；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒提取物試劑盒（康為）；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（QIAGEN）；膠回收試劑盒、2×Taq PCR Master mix（康為）；限制性內(nèi)切酶BamHI、KpnI及T4 DNA ligase 連接酶（TaKaRa）；瓊脂粉、胰蛋白胨、氨芐青霉素（OXOID）；DMEM細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、胰酶、OPti-MEM?培養(yǎng)基（gibco）；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑盒（ThermoFisher公司）；倒置熒光顯微鏡（Nikon）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫登錄的人HSPA8（NM_006597.5）基因序列，利用premer premer 5.0 軟件設(shè)計擴增HSPA8基因特異性引物，上游引物 HSPA8-F：5'-GGGGTACCTCCTACAC CC CAGCAACCATG-3'，下游引物HSPA8-R：5'-CGGGATCCGCTACATCTACACTTGGTTG GC TTA-3'，上下游分別加入酶切位點KpnI和BamH，預期擴增片段大小為1980 bp，送上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.2HSPA8基因的克隆

1.2.2.1 總RNA的提取與目的基因的擴增 在超凈工作臺內(nèi)，以人前列腺癌細胞為材料，按照Trizol說明書提取總RNA，根據(jù)康為逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行PCR反應。反應體系為20 μL，采用2×Taq PCR Master Mix試劑進行PCR擴增DNA目的片段，優(yōu)化的PCR反應體系為cDNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，RNase-Free Water 7 μL。反應程序為：95℃預變性5 min；94℃變性 30 s，63℃ 退火30 s，72℃延伸 1 min 30 s，35個循環(huán)；72℃終延伸 5 min。擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，如檢測結(jié)果均正確，送上海英俊生物技術(shù)有限公司測序，檢測其準確性，用于下一步實驗。

1.2.2.2 pMD-19-HSPA8亞克隆載體的構(gòu)建 將PCR膠回收產(chǎn)物按照說明書連接pMD19-T載體，連接體系 10 μL ：PCR 產(chǎn)物 4 μL，p MD19-T 1 μL，Solution I 5 μL，在16℃條件下連接過夜或更長。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞，挑選單菌落進行擴大培養(yǎng)，12 h后進行菌液PCR鑒定，對鑒定為陽性的菌液進行質(zhì)粒提取，利用雙酶切進一步鑒定其正確性，用于下一步實驗。雙酶切體系為20μL ：質(zhì)粒 6 μL、Buffer 2 μL、限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI各 1 μL、ddH2O 10 μL，37℃水浴鍋酶切 3 h，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，菌液PCR鑒定和雙酶切鑒定均正確的質(zhì)粒，裝樣送上海英俊生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.2.3HSPA8基因的生物信息學分析 利用生物信息學在線軟件ProtParam、SOPMA及SWISS-MODE對HSPA8基因理化性質(zhì)分析、二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)進行預測分析，同時利用 GenBank 中登錄的人和動物HSPA8基因序列繪制遺傳進化樹，并運用在線軟件STRING、PSORT II Prediction對HSPA8相互作用蛋白和HSPA8蛋白亞細胞定位進行預測分析。

1.2.4 pEGFP-C1-HSPA8重組真核表達載體的構(gòu)建 以構(gòu)建的T克隆載體為模板，采用KpnI、BamH I 兩種限制性內(nèi)切酶分別酶切pMD-19-HSPA8和pEGFP-C1兩質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別膠回收目的片段，將pEGFP-C1與pMD-19-HSPA8目的片段的膠回收產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA ligase 16℃過夜連接，采用含卡那霉素的LB瓊脂平板篩選陽性菌落，構(gòu)建pEGFP-C1-HSPA8重組真核表達載體。（構(gòu)建方法同2.2亞克隆載體的構(gòu)建）。

1.2.5 pEGFP-C1-HSPA8真核表達載體在HEK-293T細胞中的表達及亞細胞定位 將培養(yǎng)至對數(shù)期的HEK-293T細胞接種于8孔細胞培養(yǎng)板進行培養(yǎng)，待細胞匯合度達到80%左右進行轉(zhuǎn)染，以pEGFP-C1空載體為對照組，pEGFP-C1-HSPA8為試驗組，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進行轉(zhuǎn)染，置于37℃含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 h后進行亞細胞定位實驗。具體參照趙佳福等［14］在研究從江香豬亞細胞定位情況中實驗步驟（固定、破膜、染核在暗室操作）。

2 結(jié)果

2.1 pMD-19-HSPA8亞克隆載體鑒定結(jié)果

挑取單菌落，進行菌液PCR鑒定，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其正確性，結(jié)果顯示，在1、2、3泳道出現(xiàn)1980 bp目的條帶，見圖1；提取對應菌株的質(zhì)粒DNA，采用KpnI、BamH I兩種酶進行雙酶切鑒定，結(jié)果顯示在1、2、3泳道出現(xiàn)1980 bp和2692 bp兩條亮帶，結(jié)果見圖2，表明對應的菌株已成功將目的基因克隆進載體pMD-19中。

2.2 生物信息學分析結(jié)果

2.2.1 人HSPA8蛋白理化性質(zhì)分析 利用在線軟件（https：//web.expasy.org/protparam/） 對 HSPA8蛋 白理化性質(zhì)進行預測，結(jié)果顯示人HSPA8基因的CDS區(qū)全長為1941 bp，分子式為C3111H4998N860O994S17，蛋白的分子量為70.89 kD，共編碼646個氨基酸，其中含量較高的氨 基酸有賴氨酸（8.4%）、甘氨酸（8.2%）和丙氨酸（7.7%），含量較少的是組氨酸（1.1%）、胱氨酸（0.6%）和色氨酸（0.3%）；帶正電荷的殘基總數(shù)（精氨酸+賴氨酸）82個，帶負電的殘基總數(shù)（天冬氨酸 + 谷氨酸）95個，其在哺乳動物體外網(wǎng)織紅細胞中的半衰期為30 h，在酵母體內(nèi)大于20 h，大腸桿菌體內(nèi)大于10 h，理論等電點為5.37，預測HSPA8蛋白屬于親水性蛋白。

圖1 PCR擴增凝膠電泳檢測結(jié)果

圖2 雙酶切凝膠電泳檢測結(jié)果

2.2.2 HSPA8蛋白二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果 在線軟件SOPMA對HSPA8蛋白二級結(jié)構(gòu)的預測結(jié)果顯示：HSPA8蛋白二級結(jié)構(gòu)豐富，其中α-螺旋占41.64%，延伸鏈占18.42%，β-轉(zhuǎn)角占7.74%，無規(guī)則卷曲占32.20%（圖 3）。

2.2.3 HSPA8蛋白三級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果 在線軟件SWISS-MODEL對HSPA8蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果見圖4，該蛋白中α-螺旋和無規(guī)卷曲所占比列最高，與二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果相符。

2.2.4 人HSPA8基因遺傳進化分析 運用生物信息學軟件MEGA6.0繪制人與其他動物HSPA8基因的遺傳進化樹。由圖5可知，人與黑猩猩的HSPA8基因位于同一分支，遺傳距離最近；而與虹鱒魚的HSPA8基因位于不同分支，且遺傳距離最遠。

圖3 HSPA8蛋白二級結(jié)構(gòu)預測

圖4 HSPA8蛋白三級結(jié)構(gòu)預測

圖5 人與其他動物HSPA8基因系統(tǒng)進化樹

2.2.5 與HSPA8相互作用的蛋白 通過STRING在線軟件分析與HSPA8相互作用蛋白，結(jié)果顯示：HSPA8蛋 白 與 BAG2、BAG5、DNAJB1、DNAJB6、DNAJC3、DNAJC5、DNAJC6、GAK、HSP90A1A和HSP90AB1等10種蛋白具有蛋白間相互作用（圖 6）。

圖6 與HSPA8相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)

2.2.6 HSPA8蛋白的亞細胞定位預測 利用在線軟件PSORT II Prediction對HSPA8蛋白的亞細胞定位，結(jié)果顯示：HSPA8蛋白的細胞定位在細胞質(zhì)中占65.2%，細胞核占30.4%，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)占4.4%。

2.3 pEGFP-C1-HSPA8重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果

經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化后，挑取單菌落，進行菌液PCR鑒定，結(jié)果如圖7，在泳道1-2出現(xiàn)1980 bp的亮帶，提取對應泳道質(zhì)粒進行雙酶切鑒定（圖8），2個酶切產(chǎn)物檢測均在1980 bp和4700 bp左右出現(xiàn)單一亮帶，表明pEGFP-C1-HSPA8真核表達載體已構(gòu)建成功。

圖7 菌液PCR凝膠電泳檢測結(jié)果

2.4 熒光共定位檢測HSPA8蛋白在細胞中的定位

通過熒光共定位檢測發(fā)現(xiàn)（圖9），HSPA8蛋白在細胞質(zhì)與細胞核中均有表達，均勻分布于整個細胞。

圖8雙酶切凝膠電泳檢測結(jié)果

圖9 瞬時轉(zhuǎn)染HEK-293T細胞熒光顯微鏡觀察

3 討論

大量研究表明，HSPA8與諸多細胞功能存在聯(lián)系。在哺乳動物細胞質(zhì)和細胞核中，伴侶輔助因子通過調(diào)節(jié)HSPA8活性來調(diào)控ATP的結(jié)合與水解，如抗凋亡蛋白BAG-1依賴HSP40加速刺激HSPA8對ATP的水解，推動ATP與ADP之間的循環(huán)［14］，HSPA8的另一主要細胞功能是參與蛋白質(zhì)折疊，不僅結(jié)合未折疊的新合成蛋白質(zhì)，還與各種蛋白質(zhì)聚集體相互作用并減少其形成［15］。此外，HSPA8在細胞蛋白質(zhì)降解過程中發(fā)揮重要作用，如在ACT（肌動蛋白），CRYA（晶狀體蛋白）或HIS2H2AC /H2A進行泛素化及其隨后的蛋白酶體降解，都需要HSPA8的參與［16］。隨著HSPA8的深入研究，發(fā)現(xiàn)HSPA8蛋白與多種疾病蛋白存在相互作用，如博爾納病毒蛋白X、乳頭瘤病毒蛋白L229和流感病毒蛋白M1等，這些相互作用與其核質(zhì)穿梭特性相結(jié)合，使HSPA8分子伴侶在病毒感染過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。α-突觸核蛋白在退化的多巴胺神經(jīng)元中積累是帕金森病（Parkinson’s disease，PD）的主要致病蛋白，而HSPA8能有效地分離α-突觸核蛋白，并促進解聚成無毒的α-突觸核蛋白單體［17］。甲基轉(zhuǎn)移酶METTL21A能夠甲基化HSPA8蛋白，且改變HSPA8對帕金森病相關(guān)蛋白α-突觸核蛋白的單體和纖維形式的親和力，而HSPA8的C末端尾部中的靶賴氨酸的突變消除了它們的甲基化［18］。因此HSPA8活性對預防PD病理學至關(guān)重要。近年一些研究報道，HSPA8對腫瘤與癌細胞的擴散與抑制存在一定聯(lián)系，HSPA8能夠抑制腫瘤細胞生長并改變細胞活力［19］，這對于癌癥治療的藥物靶標具有重要意義。如山楂酸（Maslinic acid，MA）是一種天然五環(huán)三萜，對各種類型的癌細胞都具有細胞毒活性，MA能夠通過下調(diào)Panc-28細胞中的HSPA8誘導自噬［20］。

本研究克隆人HSPA8基因CDS區(qū)，序列比對分析發(fā)現(xiàn)人與黑猩猩的同源性最高（99%），這與HSPA8基因遺傳進化樹結(jié)果相一致，說明人與黑猩猩親源關(guān)系最近。HSPA8蛋白分析發(fā)現(xiàn)，HSPA8蛋白存在N-末端核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Nucleotidebinding domain，NBD）和C-末端底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Substrate-binding domain，SBD），兩個結(jié)構(gòu)域是變構(gòu)偶聯(lián)的，NBD負責結(jié)合和水解ATP，SBD與底物蛋白結(jié)合；HSPA8蛋白相互作用預測顯示，與之作用的蛋白共10種，主要包括J蛋白家族與BAG家族。BAG家族多個成員作為HSPA8伴侶蛋白，促進HSP70和HSC70蛋白釋放ADP的核苷酸交換因子（Nucleotide exchange factor，NEF），從而觸發(fā)底物蛋白釋放，通過與HSPA8的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合介導核苷酸釋放，與底物結(jié)構(gòu)域結(jié)合介導底物釋放［21］。如BAG1和BAG3的BAG結(jié)構(gòu)域和HSPA8 NBD之間的相互作用介導核苷酸的釋放，從而加速HSPA8中ADP釋放［22］。J蛋白家族成員主要通過J結(jié)構(gòu)域與HSPA8結(jié)合。在預測的蛋白中共有4個J蛋白家族成員，值得注意的是DNAJC6在早發(fā)性PD中存在突變［23］，是否暗示DNAJC6與HSPA8相互作用對PD具有重要調(diào)控作用。除了預測的成員外，在線人類孟德爾遺傳（Online mendelian inheritance in man，OMIM）數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，HSPA8還與其他大量的J蛋白家族成員存在相互作用，如DNAJB2、DNAJC21和DNAJC7等；蛋白亞細胞定位預測顯示，人HSPA8蛋白主要定位在細胞質(zhì)（65.2%），通過HSPA8蛋白與EGFP融合表達，發(fā)現(xiàn)該蛋白均勻分布于整個細胞，這與預測結(jié)果存在差異，但該結(jié)果與Rashedan等［24］研究一致。進一步通過癌癥基因組（The cancer genome atlas，TCGA）計劃數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，人HSPA8蛋白主要分布在細胞膜與細胞核，這與本實驗結(jié)果相符。同時在TCGA數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)HSPA8與 DNAJC21、HDJC9、DNAJB12和 DNAJB14存 在相互作用，其中DNAJC21和HDJC9主要定位在細胞核，通過與HSPA8相互作用來維持細胞的正常形態(tài)與功能［25-26］；DNAJB12和DNAJB14是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的跨膜蛋白，其作為HSPA8蛋白的伴侶蛋白，可將HSPA8招募到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，對膜蛋白中錯誤折疊的蛋白進行降解［27］。這些研究表明HSPA8通過定位至細胞核與細胞膜來行使功能，進一步驗證HSPA8蛋白定位于細胞膜與細胞核。此外，研究發(fā)現(xiàn)，HSPA8蛋白在熱誘導的應激過程中被抑制，HSPA8蛋白被限制在細胞核內(nèi)［28］，表明HSPA8可在細胞核與細胞質(zhì)間穿梭，該過程受何種蛋白調(diào)控，以及限制在核內(nèi)行使的功能還需進一步研究。本研究成功克隆人HSPA8基因CDS區(qū)，生物信息學分析和亞細胞定位結(jié)果為今后深入研究該基因的生物學功能及全面了解HSPA8在細胞內(nèi)的作用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

成功克隆了人HSPA8基因CDS區(qū)，并對序列進行生物信息學分析。構(gòu)建了pEGFP-HSPA8真核表達載體，亞細胞定位研究發(fā)現(xiàn)HSPA8-GFP融合蛋白均勻地分布在293-T細胞中。