黑順片關(guān)節(jié)腔注射干預(yù)大鼠骨性關(guān)節(jié)炎的藥效作用*

姚 蘭 王春雷

1浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州310053 2浙江省腫瘤醫(yī)院 浙江 杭州310022

附子為毛茛科植物烏頭的側(cè)根，味辛，溫，有大毒，歸腎、脾經(jīng)，始見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》。附子乃“回陽(yáng)救逆第一品”，有補(bǔ)火助陽(yáng)，散寒止痛之功，主治陰盛格陽(yáng)，大汗亡陽(yáng)，風(fēng)寒濕痹，臨床上常用于亡陽(yáng)虛脫、肢冷脈微等?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，附子具有強(qiáng)心、抗心律失常、抗血栓、抗腫瘤、免疫抑制等多方藥理作用。附子化學(xué)成分復(fù)雜，主要分為生物堿類、多糖、脂質(zhì)類等，其活性成分兼毒性成分為烏頭堿、次烏頭堿與新烏頭堿。因而，限制了附子在臨床上的應(yīng)用。為了降低或消除附子毒性，前人采用各種炮制工藝，得到了多種加工品。黑順片即為制附子中的一種，它保留了附子大部分藥用成分，但藥性溫和。因此本實(shí)驗(yàn)選用黑順片進(jìn)行研究，探討黑順片對(duì)于骨性關(guān)節(jié)炎（OA）的治療效果。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD 大鼠40只，雌性，體重200±20g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016。大鼠飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心內(nèi)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程均在該實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)屏障環(huán)境中完成。

1.2 試劑及儀器：IMDM 培養(yǎng)基（HyClone）、FBS 胎牛血清（Cellmax）、PBS 磷酸鹽緩沖液（HyClone）、青鏈霉素混合液（Gibco）、碘乙酸（SIGMA-ALDRICH）、二型膠原酶（worthingyton）、EDTA 脫 鈣 液（Solarbio）、TaKaRa Prime ScriptTM RT reagent Kit，YLS-3E 電子壓痛儀（安徽省淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）、足底熱輻射測(cè)痛儀（37370，意大利UGO BASILE）、MDF-J281AT 超低溫冰箱（SANYO），DK-S12型恒溫水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、SW-CJ-1F 層流超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、AXiovert200熒光倒置顯微鏡（Olympus ckx41）、全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（BioTek）、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo）。

2 方法

2.1 黑順片水提物制備：取黑順片（四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司，生產(chǎn)批號(hào)180702），參照先前的研究方法對(duì)黑順片進(jìn)行提取制備[1]。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將黑順片磨成粉末，在10倍純水中浸泡30min，加熱回流提取30min。過(guò)濾后收集水提液，殘?jiān)尤?倍水，繼續(xù)加熱回流30min。過(guò)濾收集第2次水提液。合并兩次煎液，真空減壓加熱濃縮1g/ml，水煎液以5000r/min 離心10min，取上清液即得。

2.2 高效液相測(cè)定黑順片水煎液中的3種生物堿：精密稱取新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品，加入二氯甲烷定容，充分搖勻溶解作為對(duì)照品溶液。取“2.1”中制備的黑順片水提液，制備成供試品溶液。色譜條件：Hypersil-BDS 柱（250.0mm×4.6mm，5.0μm）；以甲醇-水-氯仿-三乙胺（100：50：3：0.15）為流動(dòng)相，流速：1ml/min，柱溫30℃，進(jìn)量樣5μl。分別取適量標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 大鼠原代軟骨的分離提?。喝?周齡SD 大鼠脫頸處死，置于75%酒精中浸泡5min。將取出的膝關(guān)節(jié)置于PBS 中洗凈。無(wú)菌條件下，用手術(shù)刀片分離出軟骨關(guān)節(jié)面。分離出的軟骨用PBS清洗3次后，用手術(shù)剪將其剪碎至1mm3大小，裝入試管中。先用0.25%胰蛋白酶37℃水浴消化30min，后換0.20%二型膠原酶消化4h，每30min振蕩1次。終止消化，采用DMEM培養(yǎng)液，加入10%胎牛血清，青霉素100u/ml，鏈霉素100u/ml。用70μm細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，濾液離心，棄上清。將得到的細(xì)胞團(tuán)塊重懸后，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察貼壁情況，換液傳代后備用。

2.4 造模及給藥處理：將30只SD 大鼠隨機(jī)分為空白組、OA 模型組、黑順片治療組（200μg/ml），每組10只。OA 模型組、黑順片治療組大鼠通過(guò)向雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)各注射25mg·ml-1碘乙酸50μl 進(jìn)行OA 造模，對(duì)空白組大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)各注射25mg/ml 生理鹽水50μl。造模1周后，向黑順片治療組大鼠雙側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)腔分別注射50μl黑順片水提物，向空白組和OA模型組大鼠膝關(guān)節(jié)腔注射等量生理鹽水，每周1次，共注射4次。4周后，處死大鼠，進(jìn)行取樣分析。

2.5 檢測(cè)指標(biāo)：分述如下。

2.5.1MTT：取2代大鼠原代軟骨細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×104/ml，接種到96孔板中，置于37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行藥物干預(yù)。設(shè)置空白組，多濃度梯度黑順片水提物組（分別為100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml）。24h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，并繪制細(xì)胞增殖曲線。

2.5.2壓痛實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用YLS-3E 電子壓痛儀測(cè)定大鼠的痛閾。將大鼠裝入固定桶內(nèi)，使動(dòng)物處于舒適又起固定作用的狀態(tài)，用扁型頭對(duì)大鼠雙側(cè)后足背施壓，當(dāng)動(dòng)物因疼痛出現(xiàn)鳴叫或掙扎時(shí)顯示的壓力值即為此動(dòng)物的痛閾值。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前測(cè)定基礎(chǔ)痛閾，于造模后的第4周測(cè)定痛閾。

2.5.3熱痛實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用足底熱痛敏測(cè)試儀檢測(cè)大鼠雙側(cè)后足趾熱痛閾值。測(cè)量時(shí)，將大鼠置于透明有機(jī)玻璃箱內(nèi)，室溫保持在25±2℃。大鼠安靜后（停止梳理毛發(fā)和探索性活動(dòng)），將測(cè)試儀上的“十”字形標(biāo)記置于大鼠左后跖足底中央并避開(kāi)足墊。開(kāi)啟儀器，從開(kāi)始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避的時(shí)間作為大鼠的熱痛閾值。每只腳照射3次，每次間隔5～6min。為防止大鼠被熱輻射燙傷，我們將熱痛閾值測(cè)定的時(shí)間上限值設(shè)定為20s，溫度上限值設(shè)定為35℃。實(shí)驗(yàn)于每次壓痛實(shí)驗(yàn)后的6h進(jìn)行測(cè)定。

2.5.4組織病理學(xué)：造模后4周，將所有大鼠處死，取出膝關(guān)節(jié)，4%多聚甲醛固定48h，然后用EDTA脫鈣4周。脫鈣完成后，酒精逐級(jí)脫水，石蠟包埋，切片取樣。切片常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)蒸餾水沖洗后進(jìn)行番紅O染色、封片。光鏡下觀察組織病理學(xué)改變。參照Mankin’s 軟骨組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行Mankin’s評(píng)分。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用SPSS20.0進(jìn)行多重比較分析。大鼠的痛閾值檢測(cè)、Mankin’s 評(píng)分、吸光度總體比較均采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD 檢驗(yàn)，兩兩比較均采用student-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 高效液相色譜圖：取供試品進(jìn)樣檢測(cè)，所得色譜圖如圖1所示。

圖1 水煎30min黑順片HPLC色譜圖

3.2 MTT 細(xì)胞活性：黑順片水提物直接作用大鼠原代軟骨細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。從圖224h、48h 細(xì)胞增殖曲線可知，當(dāng)黑順片水提物濃度為200μg/ml 時(shí)，大鼠原代軟骨細(xì)胞的增殖率達(dá)到峰值。當(dāng)水提物濃度低于200μg/ml時(shí)，其對(duì)原代軟骨細(xì)胞的增殖率呈依賴性增長(zhǎng)；當(dāng)水提物濃度高于200μg/ml時(shí)，其增殖作用有所下降。水提物濃度為1000μg/ml時(shí)，在作用24h 后，對(duì)大鼠原代軟骨細(xì)胞無(wú)明顯增殖效果。黑順片水提物對(duì)細(xì)胞處理時(shí)間達(dá)到48h，在800μg/ml時(shí)，增殖率為0；當(dāng)水提物濃度為1000μg/ml時(shí)，出現(xiàn)了抑制大鼠原代軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)的效果。

3.3 壓痛閾值和熱痛閾值檢測(cè)結(jié)果：疼痛行為學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，3組大鼠的壓痛、熱痛閾值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與正常組相比，碘乙酸模型組的壓痛閾值和熱痛閾值低于正常組，證明大鼠疼痛骨性關(guān)節(jié)炎模型制備成功。經(jīng)黑順片水提物的治療，其壓痛閾值和熱痛閾值顯著提高（P＜0.01），有效緩解大鼠的疼痛。

圖2 不同濃度黑順片水提物對(duì)軟骨細(xì)胞作用結(jié)果

圖3 大鼠熱痛閾值和壓痛閾值

3.4 病理學(xué)結(jié)果與Mankin’s評(píng)分結(jié)果：如圖4所示，對(duì)照組大鼠膝關(guān)節(jié)面光滑完整，軟骨細(xì)胞排列規(guī)整，軟骨下骨中骨小梁形態(tài)及分布正常。而在OA 模型組的大鼠膝關(guān)節(jié)發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的關(guān)節(jié)退變，伴隨著關(guān)節(jié)軟骨喪失，軟骨細(xì)胞損失，膠原破壞。與模型組相比，黑順片治療組有效地逆轉(zhuǎn)了這種損傷，軟骨面光滑完整，軟骨細(xì)胞排列整齊。

相應(yīng)的Mankin’s 評(píng)分結(jié)果顯示，正常組得分低于模型組（P＜0.01），黑順片治療組得分也低于模型組（P＜0.01），如圖5所示。

圖4 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理切片（番紅染色×100）

圖5 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理Mankin’s評(píng)分

4 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，OA 屬于“骨痹”“痛痹”范疇，肝腎陽(yáng)虛是本病發(fā)病基礎(chǔ)之一，風(fēng)寒濕邪侵襲及跌撲扭傷為發(fā)病誘因。因此，治療骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵在于補(bǔ)腎扶陽(yáng)、驅(qū)寒除濕[2]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)疏》言“附子，藥性大熱而善走，故亦善除風(fēng)寒濕三邪，三邪祛則諸證自療矣”。黑順片是附子最常見(jiàn)的炮制品，被廣泛應(yīng)用于臨床，主要用于散寒止痛、抗關(guān)節(jié)炎等。本實(shí)驗(yàn)中，黑順片經(jīng)過(guò)減毒處理，使其毒性大大降低，但依舊保留其有效成分。實(shí)驗(yàn)觀察黑順片水提物對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞的活性影響，發(fā)現(xiàn)黑順片水提物對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞有較強(qiáng)的促增殖作用，且存在峰值，即200μg/ml。大于800μg/ml高濃度的黑順片水提物出現(xiàn)抑制的作用，可能是水提物中的有毒成分含量過(guò)高，作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致。此結(jié)果為附子解毒后的安全范圍、作用時(shí)間提供了依據(jù)，提示了在應(yīng)用黑順片過(guò)程中，應(yīng)兼顧用藥劑量和用藥時(shí)間。

碘乙酸誘導(dǎo)的大鼠模型是一種微創(chuàng)且成模塊的骨性關(guān)節(jié)炎模型，再現(xiàn)了組織形態(tài)學(xué)和功能關(guān)節(jié)損傷以及類似人類的疼痛行為。通過(guò)關(guān)節(jié)腔注射不同劑量的碘乙酸，可人為控制模型中骨性關(guān)節(jié)炎病變的嚴(yán)重程度。通過(guò)關(guān)節(jié)腔注射法注射適量碘乙酸后，大鼠機(jī)械痛和熱痛的閾值明顯下降，由此確定成功制備疼痛骨性關(guān)節(jié)炎模型。關(guān)節(jié)腔注射給藥是一種常見(jiàn)的給藥方式，臨床上用于治療骨性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)創(chuàng)傷等癥，該方法極大地改善胃腸道不良反應(yīng)，提高生物利用度。藥物直接作用靶點(diǎn)的同時(shí)，也提高了用藥安全性。本研究中，利用碘乙酸模型確定黑順片水提物對(duì)大鼠骨性關(guān)節(jié)炎的治療作用。實(shí)驗(yàn)采用關(guān)節(jié)腔注射給藥的方式，可以大大降低黑順片對(duì)大鼠產(chǎn)生的毒性影響，且治療靶點(diǎn)明確。結(jié)果顯示，黑順片治療組的軟骨破壞程度減輕，軟骨細(xì)胞損失減少。根據(jù)疼痛結(jié)果顯示，黑順片能有效提高膝關(guān)節(jié)炎的痛域。提示黑順片可以修復(fù)受損關(guān)節(jié)軟骨，恢復(fù)關(guān)節(jié)功能，有效減輕OA寒濕痹阻證大鼠的膝關(guān)節(jié)疼痛癥狀，且效果顯著。

黑順片水提物中抗OA 作用的有效成分還需要進(jìn)一步研究。對(duì)于黑順片保護(hù)軟骨細(xì)胞，促進(jìn)軟骨再生，以及受損關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)過(guò)程和機(jī)制還未可知，需要深入探討。