Phb2/REA過表達慢病毒載體對體外Th17分化條件下小鼠單核細胞IL-17a表達的影響

譚卉卉，林燦輝，李街青，陳佳玲，史建強*，陳嶸祎,*，劉 勝波（.廣東醫(yī)科大學，廣東 湛江 5403；.廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，廣東湛江 5400）

國內(nèi)外大量研究表明IL-17可參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、銀屑病、類風濕性關(guān)節(jié)炎、腦脊髓炎等多種自身免疫性疾病的發(fā)病環(huán)節(jié)[1-4]，也可以通過誘導炎癥介質(zhì)及趨化因子的產(chǎn)生而導致機體組織器官的損傷。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，雌二醇(E2)與ER結(jié)合后可以募集雌激素活性抑制因子(REA)，作用于維甲酸依賴性孤核受體γt(ROR-γt)啟動子區(qū)域的雌激素反應元件(ERE)，抑制ROR-γt的表達，從而抑制Th17分化[5]。但E2有抑制炎癥和促進炎癥的雙重作用，不但可以通過上調(diào)REA、抑制RORγt表達以遏制Th17細胞的分化，還可促進Th2細胞及漿細胞分化分泌自身免疫性抗體，參與SLE發(fā)病，因此不能直接采用E2治療SLE。抑制素2(PHB2)是蛋白抑制素家族中的一員[6]，可選擇性地抑制ER的轉(zhuǎn)錄活性，有效抑制Th17細胞分化及IL-17表達。由于REA-慢病毒過表達技術(shù)能夠穩(wěn)定表達REA，因此我們通過該項技術(shù)上調(diào)REA的表達、抑制Th17細胞的分化，進而減少IL-17的分泌，以期驗證該方法治療SLE的可行性。

1 材料和方法

1.1 Phb2過表達慢病毒載體

慢病毒載體的構(gòu)建、合成、測試均由上海吉凱基因化學技術(shù)有限公司提供，本實驗最終所制備的GV358-Phb2過表達慢病毒載體元件順序：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin。陰性對照病毒CON248(對應目的病毒)元件順序：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP。

1.2 小鼠脾臟T淋巴細胞的分離和純化

頸椎脫臼法處死C57/BL6J小鼠后置于75%酒精溶液中浸泡2 min，超凈工作臺(SW-CJ-2FD蘇凈安泰)中取出小鼠脾臟，置于盛有PBS(20012-043)的培養(yǎng)皿(60 mm)中；剔除脾臟以外多余的脂肪組織，并予PBS漂洗2次；剪碎脾臟，用磨砂玻片輕輕研磨至組織發(fā)白，再將研磨液轉(zhuǎn)移至細胞篩(70 μm)中過濾，獲得細胞懸濁液，混合均勻后用吸管將細胞懸液轉(zhuǎn)移至盛有小鼠淋巴細胞分離液的離心管中(注意不要將分離液粘在管壁上)，使細胞懸濁液懸于淋巴細胞分離液上，再將懸液以500 r/min離心30 min，吸取從上數(shù)第二層懸液至新的離心管中，并予PBS重懸，吹打混勻，以320 r/min離心5 min，棄上清，加2 mL紅細胞裂解液(PBS : 紅細胞裂解液=4 : 1)，用吸管伸至離心管底部吹打混勻5 min后再加8 mL PBS終止裂解反應，再次吹打混勻，以320 r/min 離心5 min，棄上清。再次加入PBS液清洗1遍，棄上清，予PBS重懸。采用免疫磁珠法分離純化T淋巴細胞[6]，最后加入1 mL(FBS+RPMI-1640)培養(yǎng)基重懸，細胞計數(shù)，鑒定細胞活力。

1.3 慢病毒轉(zhuǎn)染淋巴細胞

實驗設立5個組：空白組、空載體組、慢病毒組、Th17分化組和Th17+慢病毒組。每皿加入2 mL培養(yǎng)基并接種1×107個淋巴細胞，置37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。按照預實驗所得的細胞最適MOI(multiplicity of infection) 值為10，計算出所需要的病毒體積[病毒體積=(MOI×細胞數(shù))/病毒滴度]；空載體組加入不含目的基因的病毒液；慢病毒組加入病毒液，置37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 h后，將其分別轉(zhuǎn)移至5支15 mL離心管中，以300 r/min 離心 5 min后棄上清，予4 mL常規(guī)培養(yǎng)液重懸，如表1分別加入刺激因子。提前2 h以anti-CD1=3ε(2 mg/L，Biolegend，Cat.100314) 分別覆蓋6個直徑6 cm的培養(yǎng)皿中，37 ℃ 孵化2 h，再予PBS漂洗2次備用。將加入上述刺激因子的重懸液分別轉(zhuǎn)移到備用的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)72 h后收集細胞，詳細過程可參考文獻[8]，于熒光顯微鏡下觀察并測定轉(zhuǎn)染效率，最后提取RNA行Realtime-PCR檢測。

1.4 RT-qPCR檢測

收集上述5組細胞，使用RNeasy Mini kit (QIAGEN，Cat.74106) 提取細胞RNA，用iScript cDNA合成試劑盒(BIO-RAD，Cat.170-8891)進行逆轉(zhuǎn)錄，加入iQ SYBR Green Supermix DNA聚合酶混合物(BIORAD，Cat.170-8882)后，使用Master Cycler Gradient PCR儀(擴增條件為95 ℃ 30 s預變性→95 ℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個循環(huán)→熒光融解得到融解曲線)檢測REA、IL-17a、RORγt、GAPDH的mRNA表達情況。REA、IL-17a、RORγt、GAPDH引物序列見表2。

表1 5組細胞的處理方法

表2 REA、IL-17a、RORγt、GAPDH引物序列

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料以±s表示，采用單因素方差分析和Dunnett’s T3檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Phb2/REA慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠淋巴細胞

熒光表達約80%，細胞生長良好，REA過表達慢病毒轉(zhuǎn)染成功，見圖1。

圖1 病毒轉(zhuǎn)染后72 h熒光圖

2.2 RT-qPCR檢測

Th17+慢病毒組的REA、RORγt mRNA表達較慢病毒組高，且慢病毒組、Th17+慢病毒組REA、RORγt的mRNA明顯高于Th17分化組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或0.01)；空載體組與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2、3。Th17分化組的IL-17A mRNA表達明顯上調(diào)(P<0.01)，且高于Th17+慢病毒組(P<0.01)；空白組、空載體組、慢病毒組的IL-17A mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4。

圖2 細胞培養(yǎng)72 h后REA的mRNA 表達情況

圖3 細胞培養(yǎng)72 h后RORγt的mRNA表達情況

圖4 細胞培養(yǎng)72 h后 IL-17a 的mRNA表達情況

3 討論

Th17細胞是2005年發(fā)現(xiàn)的T細胞亞群，以選擇性分泌細胞因子IL-17為特征[8]，其特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子主要是RORγt[10-11]。Th17細胞的分化過程不同于Th1和Th2。當機體遭受病原體時，其先合成IL-6和TGFβ，繼而誘導T細胞表達轉(zhuǎn)錄因子RORγt，調(diào)控Th17細胞的分化。而IL-23既可以誘導IL-17的產(chǎn)生，與受體結(jié)合后也可以啟動JAK-STAT信號通路，促進Th17細胞成熟[1,12]。

E2參與細胞免疫和體液免疫的調(diào)節(jié)及抗原的呈遞，在抑制炎癥的同時也能促進炎癥的發(fā)生。E2可以通過上調(diào)REA募集HDAC1、HDAC2的方式抑制RORγt的表達[13]，遏制Th17細胞分化。其過程可能是通過抑制IL-17的分泌，亦可能是通過促進Th2細胞的分化參與SLE的發(fā)病，因此不能直接采用E2治療SLE。

我們預期采用Phb2(REA)慢病毒過表達技術(shù)促進REA表達，從而下調(diào)RORγt抑制Th17細胞的分化，探討治療SLE的可行性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Th17+慢病毒組REA和RORγt的mRNA表達較慢病毒組高，且慢病毒組和Th17+慢病毒組REA和RORγt的mRNA明顯高于TH17分化組，空載體組與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。TH17分化組IL-17A的mRNA表達明顯上調(diào)(P<0.01)，且TH17分化組IL-17的mRNA表達明顯高于Th17+慢病毒組(P<0.01)。實驗結(jié)果顯示REA上調(diào)的同時RORγt也上調(diào)，但Phb2(REA)慢病毒過表達載體在Th17分化條件下可明顯抑制IL-17A表達，表明Th17細胞的分化過程受到了抑制。雖然這一機制與E2通過RORγt抑制Th17的分化不同，但該方法卻能有效抑制IL-17A的表達，提示Phb2(REA)慢病毒過表達載體有望成為治療Th17細胞免疫紊亂相關(guān)性疾病如SLE、銀屑病等的新方案。我們推測Phb2(REA)慢病毒過表達載體未能抑制RORγt的原因可能與細胞對REA高表達的反應性，即反饋性上調(diào)RORγt的表達有關(guān)。由于實驗只是初步探討了Phb2/REA過表達慢病毒載體對Th17細胞分化的影響，至于慢病毒是通過何種途徑參與抑制Th17細胞的分化過程，其具體影響機制有待我們進一步研究。