正交法優(yōu)選六安瓜片中茶多酚的提取工藝

李林剛，周 威，鄭詩成，張世榮，王浩飛，邵海斌，余學(xué)永

(1.皖西學(xué)院 材料與化工學(xué)院，安徽 六安 237012；2.安徽仿生傳感與檢測技術(shù)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 六安 237012；3.皖西學(xué)院 外國語學(xué)院，安徽 六安 237012；4.六安市海洋羽毛有限公司，安徽 六安 237142)

茶(拉丁學(xué)名：Camellia sinensis )在我國種植面積很廣，主要分布在山區(qū)。茶葉中含有的茶多酚是一種天然的保健品，茶多酚又名茶丹寧，是從茶葉中經(jīng)過多道工序得到的多羥基酚類混合物，同時(shí)它也是茶葉中具有抗氧化功能的主要成份之一，被廣泛用作食品添加劑[1-6]，因此，茶多酚的應(yīng)用價(jià)值非常高。茶多酚的提取方法比較多，主流方法是有機(jī)溶劑萃取技術(shù)[7]，但由于有機(jī)溶劑萃取法和超臨界萃取法兩者的提純工藝較為復(fù)雜，而且提取物也會(huì)被其他有機(jī)溶劑附著，使得提取物不純凈。本實(shí)驗(yàn)主要以通過設(shè)計(jì)五因素四水平的正交實(shí)驗(yàn)，在超聲波輔助技術(shù)下研究茶多酚的工藝，并尋求最佳提取工藝條件。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品和儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品

實(shí)驗(yàn)采用的綠茶為六安瓜片(產(chǎn)地：六安大別山區(qū))；主要試劑為；主要試劑為硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和和乙醇等，等，均為分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

粉碎機(jī)(9FQ-420型，山東新圣泰機(jī)械有限公司)；超聲波清洗器(KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司)；紫外可見光柵分光光度計(jì)(Alpha-1900,上海譜元儀器有限公司)；循環(huán)水真空泵(SHB-2IIIA型，臨海市永昊真空有限公司)；電子天平(BS150M型，中國浙江紹興分析儀器)。

1.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.2.1 超聲波輔助浸提

準(zhǔn)確稱取1.0000 g左右茶葉用攪碎機(jī)攪碎后過60目篩放置于100 ml的離心管中，加入一定量的乙醇溶液后放置于超聲波清洗機(jī)中。放置時(shí)用離心管架固定好，開啟超聲波清洗機(jī)輻射，控制好提取時(shí)間和溫度，超聲結(jié)束后立即真空抽濾。

1.2.2 茶多酚的含量測定

茶多酚含量的測定按GB/T 8313—2002《茶：茶多酚的測定》進(jìn)行。其原理是茶葉中多酚類物質(zhì)能與亞鐵離子形成紫藍(lán)色絡(luò)合物，絡(luò)合物溶液顏色的深淺與茶多酚物質(zhì)的含量成正比，通過比色法，用光密度表示茶多酚的含量。準(zhǔn)確吸取經(jīng)抽濾過后的茶多酚浸提液2 ml，注入50 ml的容量瓶中，加水8 ml和酒石酸鐵溶液10 ml,充分混合，再加pH 7.5緩沖溶液至刻度，以純水為空白對照，將以上處理的以上處理的試樣溶液裝于10 mm比色中，并于540 nm處測定吸光度A，每個(gè)試樣重復(fù)測定3次，茶多酚的提取率按以下公式(1)計(jì)算

(1)

上式中：V1為試液的總體積/ml；V2為測定時(shí)所用試液體積/ml；M為茶粉的質(zhì)量/g；A為試樣的吸光度；1.957為用10 mm比色杯，當(dāng)吸光度等于0.50時(shí)，每毫升茶湯中所含茶多酚的質(zhì)量/mg。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對六安瓜片中茶多酚提取率的影響

準(zhǔn)確稱取6份質(zhì)量為1.0000 g左右的六安瓜片粉末，然后向離心管中分別加入體積分?jǐn)?shù)從30%到80%的乙醇溶液各30 ml，每次增加10%的濃度梯度，在水浴溫度為60 ℃，超聲波功率為270 W的條件下提取45 min,經(jīng)抽濾得到茶多酚的浸提液，然后精確量取2.00 ml的濾液測定其吸光度并計(jì)算其提取率，結(jié)果見圖1。

圖1 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對六安瓜片中茶多酚提取率的影響

通過觀察圖1的趨勢可知：在一定乙醇濃度范圍內(nèi)，六安瓜片中的茶多酚提取率隨乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)的增加先升后減。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到50%時(shí)提取率取得最大值為10.30%；根據(jù)相似相溶原理，這種現(xiàn)象產(chǎn)生的主要原因是六安瓜片中的多酚類物質(zhì)具有一定強(qiáng)度的極性，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)的極性剛好與其相似，使得六安瓜片中的多酚類物質(zhì)具有最大溶解度[8]。而乙醇體積分?jǐn)?shù)低于50%時(shí)，六安瓜片中的茶多酚類物質(zhì)浸出不完全，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)高于50%又會(huì)造成除茶多酚以外的雜質(zhì)溶解出來，有效成分減少。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%左右為宜。

2.1.2 不同溫度對六安瓜片中茶多酚提取率的影響

保持乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，超聲波功率270 W，改變水浴溫度，從30 ℃增加到70 ℃，每次改變10 ℃，提取時(shí)間45 min，經(jīng)抽濾得到茶多酚的浸提液，然后精確量取2.00 ml的濾液測定其吸光度并計(jì)算其提取率，結(jié)果見圖2。

圖2 不同溫度對六安瓜片中茶多酚提取率的影響

通過觀察圖2的曲線走勢可知：在低于60℃的條件下，六安瓜片中茶多酚的提取率隨著提取溫度的升高而逐漸增大。提取溫度達(dá)到60 ℃時(shí)達(dá)到最高提取率為10.32%；當(dāng)溫度繼續(xù)升高后，可以發(fā)現(xiàn)六安瓜片中茶多酚的提取率開始下降。根據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)[8]，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度的上升會(huì)加速分子的熱運(yùn)動(dòng)，在60 ℃之前由于分子熱運(yùn)動(dòng)使得茶多酚逐漸從葉肉細(xì)胞中溶出，但一旦超過一定溫度茶多酚的活性會(huì)下降，所以溫度應(yīng)控制在60 ℃左右為宜。

2.1.3 不同超聲功率對六安瓜片中茶多酚提取率的影響

保持乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，溫度60 ℃，分別在超聲波功率為90 W、180 W、270 W、360 W、450 W、540 W的條件下處理45 min，經(jīng)抽濾得到茶多酚的浸提液，然后精確量取2.00 ml的濾液測定其吸光度并計(jì)算其提取率，結(jié)果見圖3。

圖3 不同超聲功率對六安瓜片中茶多酚提取率的影響

由圖3可以看出，超聲功率在360 W以前，隨著功率逐漸增大，茶多酚的提取率迅速上升。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因主要是因?yàn)槌暡ǖ恼駝?dòng)頻率越快，對葉肉細(xì)胞的空化作用也就越強(qiáng)[10]，所以茶多酚等物質(zhì)的溶出速度也就越快。功率一旦超過360W時(shí)，所對應(yīng)的茶多酚提取率反而會(huì)下降。這可能是由于在過高功率的提取環(huán)境下，茶多酚活性成分會(huì)有所破壞[8]。而功率過低時(shí)，超聲波對細(xì)胞壁的破壞能力不強(qiáng)從而提取率也不高。因此，360 W的功率是超聲波提取的最適功率。

2.1.4 不同超聲時(shí)間對六安瓜片中茶多酚提取率的影響

保持乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%，溫度60 ℃，超聲波功率360 W的條件下，將六份提取物分別處理30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min。經(jīng)抽濾得到茶多酚的浸提液，然后精確量取2.00 ml的濾液測定其吸光度并計(jì)算其提取率，結(jié)果見圖4。

圖4 不同時(shí)間對六安瓜片中茶多酚提取率的影響

從上圖看出，前60 min茶多芬的浸出率隨時(shí)間的增加而增大，在60 min時(shí)達(dá)到最高提取率10.40%。提取率隨提取時(shí)間的變化可分為三個(gè)階段：前期恒速擴(kuò)散段、中期降速段和提取后期段。在提取前期，茶多酚通過茶葉細(xì)胞壁向細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散，此時(shí)茶葉細(xì)胞內(nèi)有效成分含量呈現(xiàn)過飽和狀態(tài)，隨著提取時(shí)間的延長，茶葉細(xì)胞內(nèi)的茶多酚含量逐漸向非飽和狀態(tài)遷移，所以提取溶劑中茶多酚含量逐漸增大。

2.1.5 不同料液比對六安瓜片中茶多酚提取率的影響

準(zhǔn)確稱取6份質(zhì)量為1.0000 g的六安瓜片粉末，分別加入體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液15 ml、20 ml、25 ml、30 ml、35 ml、40 ml，放置于水浴溫度為60 ℃的環(huán)境下，在超聲波功率為 360 W的條件下處理60 min。經(jīng)抽濾得到茶多酚的浸提液，然后精確量取2.00 ml的濾液測定其吸光度并計(jì)算其提取率，結(jié)果見圖5。

圖5 不同料液比對六安瓜片中茶多酚提取率的影響

從上圖可以觀察出，當(dāng)液固比從15∶1增加到30∶1茶多酚的浸出率逐漸增大，液固比達(dá)到30∶1時(shí)茶多酚的提取率為10.38%；但是液固比進(jìn)一步提高時(shí)，六安瓜片中茶多酚的浸出率卻下降。這種現(xiàn)象的原因液固比的增加使得溶劑與物料之間的濃度差加大，同時(shí)也加大了茶粉與乙醇的接觸面積，從而有助于相關(guān)物質(zhì)的溶解。而液固比過大可能會(huì)導(dǎo)致提取出的雜質(zhì)增加，影響六安瓜片中茶多酚的溶出。因此，液固比宜控制在30∶1左右。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

2.2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

通過單因素實(shí)驗(yàn)，選定乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)，溫度(B)，超聲功率(C)固液比(D)時(shí)間(E)作為本實(shí)驗(yàn)的影響因素，經(jīng)過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，最終確定了正交實(shí)驗(yàn)的各因素水平，詳見表1.為探究超聲波輔助法提取六安瓜片中茶多酚的最佳提取條件，選擇L16(45)正交表安排各實(shí)驗(yàn)的因素水平[9]，正交設(shè)計(jì)如表1。

根據(jù)表2的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過對比均值可以發(fā)現(xiàn)A3、B3、C2、D3、E4為最佳提取條件，并比較各列的極差結(jié)果不難看出C的極差是最大的，其次是A、D、E、B，也即超聲功率對茶多酚的提取率是最明顯的，乙醇的濃度次之。由于超聲波的三大效應(yīng)：熱效應(yīng)、機(jī)械破碎效應(yīng)、空化效應(yīng)使得葉肉細(xì)胞中的多酚物質(zhì)快速溶出其中其主要作用的是空化效應(yīng)即在一定的聲強(qiáng)下造成氣泡的產(chǎn)生，膨脹和潰滅的過程中能夠釋放很強(qiáng)的能量，一方面加速溶劑的進(jìn)入，另一方面加大了對植物細(xì)胞的剪切作用從而使得相關(guān)物質(zhì)的釋放更快[7]。

2.2.2 方差分析

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行方差分析如表3。

表1 L16(45)正交表設(shè)計(jì)

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

從表3的相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，六安瓜片中茶多酚提取率的影響因素排序從小到大分別為B、E、D、A、C，此結(jié)果基本與表2的極差分析相同。所以結(jié)合兩者數(shù)據(jù)分析的結(jié)果可得出超聲波輻射法的最優(yōu)提取條件為A3B3C2D3E4 。即最優(yōu)工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，提取溫度為60 ℃，超聲功率為270 W，料液比為1∶30，浸提時(shí)間為65 min。重復(fù)最佳提取條件實(shí)驗(yàn)得茶多酚的提取率為10.41%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以采摘于六安大別山區(qū)的六安瓜片為原料，采用超聲波輔助提取工藝技術(shù)，分別改變乙醇的體積分?jǐn)?shù)、超聲浸提時(shí)間、固液比、超聲波的震動(dòng)頻率、超聲浸提溫度，設(shè)計(jì)五因素四水平的正交實(shí)驗(yàn)，探究這五種因素對茶多酚浸提率的影響。結(jié)果表明，最優(yōu)的提取條件為：固液比為1∶30、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、超聲提取溫度為60 ℃、超聲功率為270 W、浸提時(shí)間為65 min。重復(fù)三次最優(yōu)浸提條件得茶多酚的提取率為10.41%。結(jié)合單因素處理結(jié)果，經(jīng)正交法所處理得提取條件更加接近最優(yōu)值。