普通小麥 TaZIP29-7B 基因的克隆及表達(dá)研究

張嘉程，高 翔，，董 劍，，楊明明,，李曉燕,，趙萬春,

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100; 2.陜西省小麥工程技術(shù)研究中心/陜西省小麥新品種培育工程研究中心，陜西楊凌 712100)

小麥作為人類主要糧食作物之一，其種植環(huán)境也受到巨大挑戰(zhàn)，例如高溫、干旱、凍害、鹽脅迫及重金屬污染等。金屬離子在植物的生長發(fā)育過程中起到極其重要的作用，但如果吸收過量會導(dǎo)致體內(nèi)蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆的改變，從而影響植物的正常生長發(fā)育。

鋅和鐵是生物體所必需的微量元素，在植物的生長發(fā)育過程中有著重要作用[1]。鋅不僅參與機(jī)體的各種代謝，在生物膜穩(wěn)定和基因表達(dá)調(diào)控等生理機(jī)能中也擔(dān)負(fù)著重要角色[2]，它還是生物體內(nèi)多種酶和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)輔助因子。適量增加植物體內(nèi)的鋅可提高作物產(chǎn)量，而鋅的缺乏或過量都會導(dǎo)致葉綠素、脂質(zhì)、蛋白、質(zhì)膜的氧化破壞，例如過量的鋅會破壞小麥體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)造成MDA 積累，細(xì)胞膜透性變大，致使細(xì)胞內(nèi)酶及代謝作用區(qū)域受到破壞[3]。鐵在細(xì)胞呼吸、光合作用和金屬蛋白的催化反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，是重要的電子傳遞體[4]。因此，鐵在原核和真核生物的新陳代謝過程中有著無法替換的作用。但是細(xì)胞內(nèi)過高的 Fe3+/Fe2+氧化還原勢會導(dǎo)致超氧化合物的產(chǎn)生，對細(xì)胞造成傷害[5]。因此，保證植物體內(nèi)的各種金屬離子的平衡對植物的正常生長是非常必要的，這一過程要依靠多種轉(zhuǎn)運體的共同參與，包括鋅、鐵轉(zhuǎn)運體蛋白家族(Zinc-regulated transporters，Iron-regulated transporter-like proteins，ZIP)、自然抗性相關(guān)巨噬蛋白家族(The natural resistance associated macrophage protein，NRAMP)、陽離子擴(kuò)散輔助蛋白家族(Cation diffusion facilitator proteins，CDF)、植物重金屬 ATP 酶家族 P1B-ATPase(Heavy metal ATPa-ses，HMA)、黃色條紋蛋白家族(yellow stripe-like，YSL)和三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白(ATP-binding cass-ette transporter),這些運輸?shù)鞍讓τ谥参镤\鐵吸收、體內(nèi)分配以及維持細(xì)胞內(nèi)鋅鐵離子的平衡具有重要作用[6-7]。

目前在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(OryzasativaL.)、玉米(Zeamays)等少數(shù)植物中對ZIP的研究比較多。ZIP基因家族的功能分析表明，該基因家族在從胞外向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運并在胞內(nèi)進(jìn)行鋅運輸過程中起重要作用[1]。酵母功能互補(bǔ)試驗顯示ZIP家族基因能夠轉(zhuǎn)運包括Zn2+、Fe2+、Cu2+、Cd2+在內(nèi)的多種金屬離子[8]。AtIRT3能互補(bǔ)鋅、鐵轉(zhuǎn)運雙突變體，過表達(dá)AtIRT3會使鋅在地上部、鐵在地下部積累[9]。在研究水稻ZIP家族基因時研究人員發(fā)現(xiàn)，OsIRT1過表達(dá)可使地上部、地下部和成熟種子中的鋅、鐵含量提高[10]。擬南芥中發(fā)現(xiàn)的多種ZIP家族基因中AtIRT2主要在根部表達(dá)，定位在囊泡，推測具有細(xì)胞內(nèi)過量金屬元素的解毒功能[11-12]。OsIRT1參與鎘的運輸，并且OsIRT1過表達(dá)材料提高了植株對過量鋅和鎘的敏感性[13]。在缺銅誘導(dǎo)下，AtZIP2和AtZIP5在根部表達(dá)[14]，證明這2個基因都參與了Cu2+的轉(zhuǎn)運。研究轉(zhuǎn)運蛋白功能時，一般情況下，同源基因具有類似的轉(zhuǎn)運模式的可能性比較大，但在ZIP家族中，由于其他物種與水稻生存環(huán)境的差異或者其他因素，造成同源基因的功能存在差異，例如OsZIP8受鋅誘導(dǎo)表達(dá)，過表達(dá)后會導(dǎo)致鋅在水稻體內(nèi)再分配，但在擬南芥中，ZIP8轉(zhuǎn)運蛋白對鋅，鐵，錳，銅可能都無轉(zhuǎn)運活性[15]。AtZTP29定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜在鹽脅迫下會產(chǎn)生未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，AtZTP29在參與響應(yīng)鹽脅迫的過程中，是通過調(diào)節(jié)UPR所需的鋅離子而產(chǎn)生作用[16]。

本研究克隆了小麥TaZIP29-7B基因，并利用生物信息學(xué)軟件以及在線分析，對此基因的相關(guān)信息及其編碼蛋白進(jìn)行初步分析，并對啟動子區(qū)順式作用元件做一個簡單的預(yù)測，再利用實時熒光定量PCR技術(shù)分析TaZIP29-7B基因在不同重金屬溶液處理下，其在根系及地上部分的表達(dá)特征，為進(jìn)一步發(fā)掘探索該基因的功能機(jī)制做出預(yù)測。

1 材料與方法

1.1 材 料

小麥‘西農(nóng)538’由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院高翔老師課題組提供。挑出殘缺的種子，用清水洗去雜質(zhì)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的H2O2處理10 min，再用體積分?jǐn)?shù)為70%酒精消毒處理5 min，再用蒸餾水沖洗4次，沖洗干凈，加水室溫下放置萌發(fā)，待種子萌發(fā)露白時期，選取部分?jǐn)[放至鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，放置恒溫培養(yǎng)箱中。待其生長至兩葉一心期時，給予含有重金屬的溶液的處理，然后置于室溫光照條件下培養(yǎng)。重金屬種類為鋅、鐵、銅、鎘，質(zhì)量濃度設(shè)置為200 mg/L，分別處理1、3、6、12、24 h。取葉片及根系樣品后及時用液氮處理，并保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取及其cDNA第一鏈合成

利用試劑盒RNAprep Pure Plant Kit(天根，北京)提取RNA后，然后檢測所提取的RNA的完整性后，再通過測定濃度的儀器NanoDropTM One(Thermo Scientific，美國)檢測所提取的RNA濃度，最后再使用試劑盒Prime Script TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，日本)進(jìn)行cDNA合成。

1.3 TaZIP29-7B 基因及其啟動子克隆

根據(jù)NCBI ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上公布的擬南芥AtZTP29基因(GenBank登錄號:AT3G20870)序列在在線網(wǎng)站Ensembl Plant(http://plants.ensembl.org/index.html)進(jìn)行比對，將得到的結(jié)果利用引物設(shè)計軟件Primer設(shè)計特異性引物T25-F、T25-R(表1)，以‘西農(nóng)538’ cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR體系和程序設(shè)置根據(jù)2×EsTaqMasterMix(康為世紀(jì)，北京)的說明書進(jìn)行設(shè)計，循環(huán)數(shù)為32，退火溫度為67 ℃，延伸時間1 min，體系15 μL，產(chǎn)物4 ℃下保存。凝膠電泳檢測條帶大小正確后進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收，并和克隆載體pEASY-T1(全式金，北京)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，涂至漢卡那抗生素的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下倒置培養(yǎng)。挑取單克隆菌落，菌液PCR檢測條帶大小正確后，在含卡那(50 mg/L)抗生素的液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，送公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果進(jìn)行在線比對分析以及利用軟件DNAman進(jìn)行相關(guān)分析。

利用在線網(wǎng)站Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/index.html)上尋找TaZIP29-7B基因的上游2 500 bp左右大小的序列，并設(shè)計特異性引物Q1-F和Q1-R(表1)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR體系和程序設(shè)置根據(jù)2×EsTaqMasterMix(康為世紀(jì)，北京)的說明書進(jìn)行設(shè)計，循環(huán)數(shù)為32，退火溫度為66 ℃，延伸時間2 min，體系15 μL，產(chǎn)物4 ℃下保存。利用在線軟件Promoter 2.0 Prediction Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/Promoter/)在線預(yù)測啟動子區(qū)，以及PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) 對啟動區(qū)的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步關(guān)于其順式調(diào)控元件的分析。

1.4 TaZIP29-7B 基因生物信息學(xué)分析

利用NCBI ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在線工具對目的基因的ORF進(jìn)行分析和并查找該基因的編碼蛋白，利用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線對該基因編碼的蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測，使用軟件Bioedit、ExPASy-ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)、SWISSMODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)、CBS-TargetP 1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)進(jìn)行編碼蛋白的理化性質(zhì)以及親水性/疏水性以及對蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測和亞細(xì)胞定位預(yù)測分析，通過TMpred(https://embnet.vital-it.ch/cgi-bin/TMPRED_form_parser)在線分析蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)。利用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)對目的基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析。最后通過NCBI-Blastp程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對TaZIP29-7B基因編碼氨基酸的同源性進(jìn)行分析，然后下載不同植物的ZIP蛋白序列信息，并運用ClustalX軟件對該基因的氨基酸序列和其他物種鋅鐵轉(zhuǎn)運蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多重比對，并利用軟件MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 TaZIP29-7B 基因表達(dá)分析

根據(jù)所得序列結(jié)果設(shè)計熒光定量引物QRT4-F,QRT4-R以及內(nèi)參基因Nc-F,Nc-R(表1)。利用熒光定量儀QuantStudioTM7 Flex(ABI Q7，美國)進(jìn)行qRT-PCR，體系及程序設(shè)置參照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TliRNaseH Plus) (TaKaRa，日本)說明書進(jìn)行，體系20 μL，循環(huán)數(shù)40，退火溫度 60 ℃，時間32 s。實驗設(shè)置3次重復(fù)，以保證準(zhǔn)確性。利用2-ΔΔCT法計算TaZIP29-7B基因的相對表達(dá)量。

表1 引物信息Table 1 Primers information

2 結(jié)果與分析

2.1 TaZIP29-7B 基因的獲得及基本分析

2.1.1TaZIP29-7B基因的分析 以‘西農(nóng)538’的cDNA為模板，以特異性引物T25-F，T25-R進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，得到1 000 bp左右出現(xiàn)目的條帶，進(jìn)行切膠回收后，連接轉(zhuǎn)化并測序，得到序列長度為896 bp的序列片段，利用NCBI ORF Finder在線比對分析得到834 bp大小的基因編碼區(qū)。將所得目的條帶的序列命名為TaZIP29-7B，并提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中，獲得其反饋的序列登錄號：MK203894。利用GSDS 2.0對TaZIP29-7BcDNA基因序列與基因組DNA序列進(jìn)行比對后分析結(jié)果顯示，該基因含有10個外顯子和9個內(nèi)含子(圖2)。

2.1.2TaZIP29-7B基因編碼蛋白的分析 NCBI-ORF對TaZIP29-7B基因的ORF進(jìn)行了預(yù)測，得到一段長834 bp的ORF，編碼277個氨基酸。ExPASy-ProtParam對蛋白的理化性質(zhì)分析得到蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為40.45，此種蛋白不穩(wěn)定，理論等電點6.30，總平均親水性0.715，是一種疏水性蛋白(圖3)。根據(jù)TargetP 1.1 在線分析反饋結(jié)果可知，目的蛋白TaZIP29-7B蛋白定在細(xì)胞膜上，屬于分泌通路蛋白，通過SignalP 4.1對TaZIP29-7B蛋白進(jìn)行信號肽分析，結(jié)果顯示目的蛋白存在信號肽，屬于分泌蛋白，與TargetP 1.1分析結(jié)果相符合。SMART蛋白的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測，得到一個位于目的蛋白第89～263位置間的結(jié)構(gòu)功能域ZIP，屬于典型的ZIP超級家族結(jié)構(gòu)域，參與金屬離子的跨膜轉(zhuǎn)運，對植物體內(nèi)的金屬離子的積累和平衡有著重要的作用，符合預(yù)期結(jié)果。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果如圖4所示，含有多個α螺旋，TMHMM分析結(jié)果顯示(圖5)，此蛋白有8個跨膜區(qū)，在第三到第四跨膜區(qū)之間，存在一個位于細(xì)胞內(nèi)的可變區(qū)，這一部分區(qū)域含有的完全保守的組氨酸殘基，可能與金屬離子的結(jié)合與運轉(zhuǎn)有關(guān)。

M. Trans 2K DNA marker;1.TaZIP29-7BcDNA擴(kuò)增產(chǎn)物 The amplicon ofTaZIP29-7Bfrom cDNA;；2.TaZIP29-7B啟動子擴(kuò)增產(chǎn)物 The amplicon ofTaZIP29-7Bpromoter

圖1TaZIP29-7B基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果
Fig.1 PCR amplification ofTaZIP29-7Bgene detected by agarose gel electrophoresis

圖2 TaZIP29-7B 基因結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Structure analysis of TaZIP29-7B gene

圖3 蛋白質(zhì)疏水性分析結(jié)果Fig.3 Protein hydrophobicity analysis results

圖4 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig.4 Protein tertiary structure prediction map

2.1.3 進(jìn)化樹構(gòu)建 利用MEGA 4.0對將山羊草(XP_020178053.1)、二穗短柄草(XP_010234219.1)、烏拉爾圖小麥(EMS47420.1)、玉米(XP_008644450.1)、小米(XP_004972374.1)、糜子(RLM61625.1)、粳稻(XP_015649148.1)等植物的ZIP同源蛋白與TaZIP29-7B蛋白進(jìn)行比對分析，比對分析結(jié)果顯示(圖6)，不同植物之間的鋅鐵轉(zhuǎn)運蛋白具有高度的同源性，相似度 89.94%～100%，而與小麥的同源蛋白高度一致，是具有高度保守性的。差異較大部分主要體現(xiàn)在第三與第四跨膜區(qū)間胞內(nèi)部分的可變區(qū)，但是相同點在于此處范圍內(nèi)具有組氨酸。可變區(qū)內(nèi)的組氨酸是和金屬離子的結(jié)合以及轉(zhuǎn)運有關(guān)的。在與其它科屬的植物的鋅鐵轉(zhuǎn)運蛋白比對的結(jié)果中同樣發(fā)現(xiàn)具有較大的相似性在67.87%～70.76%，所以在不同植物之間是存在較大差異的，但是其所行使的作用是基本相似的。利用MEGA6.0采用的NJ法進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建(圖7)，分析結(jié)果表明，本研究得到的TaZIP29-7B蛋白與山羊草、烏拉爾圖小麥、二穗短柄草的親緣關(guān)系最近。

圖5 跨膜區(qū)分析結(jié)果Fig.5 Transmembrane region analysis results

紅色方框代表ZIP家族獨特的氨基酸殘基 Red squares represent unique amino acid residues in the ZIP family；Ta.小麥TriticumaestivumL.；Aet. 山羊草Aegilopstauschiisubsp.tauschii；Bd. 二穗短柄草Brachypodiumdistachyon；Zm.玉米Zeamays；Si.小米Setariaitalica；Pm.糜子Panicummiliaceum；Os.粳稻OryzasativaJaponica Group；Tu.烏拉爾圖小麥Triticumurartu

圖6 小麥TaZIP29-7B不同植物間ZIP同源蛋白比對結(jié)果
Fig.6 Sequence alignment of amino acid residues of TaZIP29-7B with other related proteins

2.2 啟動子克隆及其預(yù)測結(jié)果分析

以‘西農(nóng)538’的cDNA為模板，以Q1-F/Q1-R為引物得到TaZIP29-7B基因的上游序列，測序結(jié)果比對正確后，再次電泳檢測(圖1)，對所得序列進(jìn)行啟動子區(qū)的分析，得到起始密碼子上游 1 600 bp的序列為啟動子區(qū)，轉(zhuǎn)錄起始位點預(yù)測結(jié)果顯示含有4個位點(圖8)。利用PlantCARE對啟動子作用元件進(jìn)行分析，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖9)，除了啟動子中常見的多種順式作用元件如CAAT-box，TATA-box外，還發(fā)現(xiàn)其含有多種與抗逆相關(guān)的作用元件，例如參與脫落酸反應(yīng)的元件ABRE，參與赤霉素反應(yīng)性的順式作用元件TATC-box，參與MeJA(茉莉酸甲酯)反應(yīng)性的順式作用調(diào)節(jié)元件TGACG-motif，還有依賴ABA的MYC和MYB作用元件，參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點MBS，常見的應(yīng)激反應(yīng)元件STRE，以及還發(fā)現(xiàn)多種參與光響應(yīng)的順式作用調(diào)節(jié)元件如Sp-1、G-Box、chs-Unit 1 m1。

TaZIP29-7B 基因的編碼蛋自 The deduced proteins of TaZIP29-7B gene obtained in this study.

加粗字符表示預(yù)測的轉(zhuǎn)錄起始位點 Bold characters indicate predicted transcription start sites

2.3 TaZIP29-7B 基因表達(dá)結(jié)果分析

小麥苗期在4種不同重金屬，相同的濃度條件下，在處理不同時間后，最終的檢測結(jié)果表明TaZIP29-7B在根和葉組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量不一致。

小麥苗在200 mg/L CdCl2、CuSO4溶液處理下(圖10-A,B)，根系TaZIP29-7B基因表達(dá)量呈現(xiàn)出相同的變化趨勢，在1 h內(nèi)迅速上升，然后在其后的23 h內(nèi)，TaZIP29-7B的表達(dá)量表現(xiàn)出波浪形的變化，并在24 h達(dá)到第三個峰值，表達(dá)量與對照組相比，大概為兩倍的差異，而出現(xiàn)這種變化趨勢，可能與其體內(nèi)重金屬離子的動態(tài)平衡有關(guān)。在ZnSO4溶液處理下(圖10-C)，TaZIP29-7B表達(dá)量迅速升高，在3 h時表達(dá)量降低到開始一般的水平，在12 h時達(dá)到第二個頂峰，在不間斷的處理下，表達(dá)量隨后又下降到最低的水平，基本與對照組相同。在FeSO4溶液處理下(圖10-D)，TaZIP29-7B的表達(dá)量并沒有像其他3種處理條件下的迅速升高，而是不斷上升，在6 h時達(dá)到頂點，隨后又緩慢下降，上升與下降的速率基本相似，但是最后的表達(dá)量依舊是高于對照組。相比鋅離子處理下的反應(yīng)，鐵離子的處理下TaZIP29-7B基因的表達(dá)量并不是很迅速，猜測原因在于TaZIP29-7B蛋白與鋅離子的親和性比與鐵離子的要大，所以在鋅離子處理3 h后其體內(nèi)的TaZIP29-7B表達(dá)量就迅速降低的與對照組一致的水平。也能進(jìn)一步推測鋅離子和鐵離子在植物體內(nèi)的變化情況，鋅離子能夠較快吸收并迅速達(dá)到動態(tài)平衡，而TaZIP29-7B基因針對鐵離子的響應(yīng)則較為緩慢。

圖9 TaZIP29-7B啟動子序列預(yù)測元件分析Fig.9 Predicted cis-elements in the promoter of TaZIP29-7B

在與上述溶液相同濃度的條件下，經(jīng)CdCl2，ZnSO4溶液分別處理小麥苗后(圖11-A,B)，葉片內(nèi)TaZIP29-7B基因的表達(dá)量變化趨勢呈現(xiàn)一致，先迅速升高，隨后在3 h后迅速降低，然后又在6 h時達(dá)到2個處理下的最大值，然后又一次緩慢降低，最終在24 h時處在一個較低的表達(dá)量時期。由于鎘離子的毒害較大，在24 h時植株的表型已經(jīng)明顯表現(xiàn)出其生長生理代謝嚴(yán)重受損，從而在24 h時TaZIP29-7B基因表達(dá)量直接降低到與對照組相同的水平。

在FeSO4、CuSO4溶液處理下(圖11-C,D)，葉片中TaZIP29-7B基因表達(dá)量的變化趨勢呈現(xiàn)出完全相反的狀態(tài)，在FeSO4溶液處理下，表達(dá)量隨著時間的增加而緩慢增大，在6 h時處在最高峰值，隨之下降，但是在24 h時TaZIP29-7B基因表達(dá)量依舊是高于對照組的，而在CuSO4溶液處理的過程中，TaZIP29-7B基因表達(dá)量先是緩慢下降，直到在6 h時達(dá)到最低值，而后又一路升高，在24 h時達(dá)到此種處理下的峰值，并且較對照組的表達(dá)量高出一倍有余，也證明了TaZIP29-7B蛋白參與了Cd2+、Cu2+的轉(zhuǎn)運。

3 討 論

在重金屬脅迫下，小麥的生長受到嚴(yán)重影響，細(xì)胞膜系統(tǒng)會首先受到損傷，但如果其他對植物生長具有重要作用的離子過量，依舊會對小麥的正常生長產(chǎn)生不良影響。本研究成功克隆出小麥TaZIP29-7B基因，并對其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行了預(yù)測。結(jié)果顯示，該蛋白具有ZIP家族高度保守結(jié)構(gòu)域，也因此推斷其具有鋅鐵轉(zhuǎn)運功能，能夠在體外環(huán)境重金屬離子含量出現(xiàn)變化導(dǎo)致基因表達(dá)量的變化。在對TaZIP29-7B基因編碼蛋白的功能預(yù)測出分析中發(fā)現(xiàn)，在第三和第四跨膜區(qū)間的可變區(qū)內(nèi)存在高度保守氨基酸殘基組氨酸，該區(qū)可能與金屬離子的結(jié)合、轉(zhuǎn)運有關(guān)，并且在第五跨膜區(qū)內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了ZIP家族所具有的高度保守的氨基酸殘基組氨酸，該組氨酸殘基能夠與保守的第V跨膜域形成α螺旋，是膜內(nèi)Zn2+的結(jié)合位點[17]，因此TaZIP29-7B基因編碼蛋白屬于ZIP蛋白家族。在進(jìn)化樹的構(gòu)建過程中，對氨基酸序列進(jìn)行了同源性比對分析，整個進(jìn)化樹分為單子葉植物和雙子葉植物兩部分，而TaZIP29-7B與單子葉植物中的遺傳距離很近，而雙子葉植物的較遠(yuǎn)，也說明TaZIP29-7B基因在長久的進(jìn)化過程中是比較保守的。

A～D.相同質(zhì)量濃度但不同重金屬溶液 CdCl2、CuSO4、FeSO4、ZnSO4處理下TaZIP29-7B基因在根系中的表達(dá)模式 The expression patterns ofTaZIP29-7Bgene in roots treated respectively with the same concentration of CdCl2, CuSO4,ZnSO4and FeSO4；CK.未經(jīng)重金屬溶液處理的幼苗 Seedlings without treatment of heavy metal solution；下同 The same below

圖10 根系TaZIP29-7B基因?qū)崟r定量PCR分析結(jié)果
Fig.10 Expression analysis ofTaZIP29-7Bgene by qRT-PCR

圖11 葉片 TaZIP29-7B 基因?qū)崟r定量PCR分析結(jié)果Fig.11 Expression analysis of TaZIP29-7B gene by qRT-PCR

ZIP轉(zhuǎn)運蛋白除了對植物生長所必須的營養(yǎng)元素如鋅和鐵具有轉(zhuǎn)運功能外，還參與轉(zhuǎn)運一些有害于植物的重金屬如鉛、鎘、鎳等。因此在除過鋅、鐵2種重金屬離子溶液的處理下，TaZIP29-7B基因表達(dá)量對其余2種鎘銅溶液的處理下依舊出現(xiàn)了相應(yīng)的變化，并且在根部和葉片中表達(dá)量出現(xiàn)差異性，說明TaZIP29-7B蛋白不單單只對鋅鐵離子具有專一的調(diào)控作用。在處理的不同時間內(nèi)，TaZIP29-7B基因表達(dá)量也有著明顯的差異，說明TaZIP29-7B基因?qū)︽k離子、銅離子對小麥產(chǎn)生毒害的過程中起著一定的調(diào)控作用，但是在重金屬離子濃度過高并且處理時間過久時，會引起葉綠素含量降低，光合作用受阻，氧化酶系統(tǒng)功能紊亂，核酸和蛋白質(zhì)變性，可溶性糖和淀粉合成受阻[18-20]，生理生化代謝功能受到嚴(yán)重影響，從而致使植株生長受抑制最終死亡。

研究ZIP蛋白在植物生長過程中所起的作用，無論是在正常的生產(chǎn)中還是在具有重金屬污染下的環(huán)境中的生產(chǎn)，都有一定的意義。在以往的研究中表明，AtZIP1、AtZIP5,AtZIP9,AtZIP12和AtIRT3受缺鋅誘導(dǎo)，由此可推測，這些基因在缺鋅條件下可能增強(qiáng)鋅的吸收能力[21]，例如在野生二粒小麥中克隆的TdZIP1為缺鋅誘導(dǎo)的鋅轉(zhuǎn)運體，過表達(dá)TdZIP1導(dǎo)致鋅在細(xì)胞內(nèi)的積累產(chǎn)生細(xì)胞毒性[22]，但是在對重金屬脅迫下的功能并無研究。由于不同金屬離子處于動態(tài)平衡之中，互相影響，一種元素的變化會影響到一些轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)變化，最終導(dǎo)致金屬離子含量變化[13]。ZIP家族在參與多種金屬離子運輸過程中起著重要的作用，包括一些對植物具有毒害作用的金屬離子，同樣受到ZIP轉(zhuǎn)運蛋白的調(diào)控。正常環(huán)境中，它對植物生長過程中促進(jìn)金屬離子的吸收起到良性的積極作用，而在含有毒性重金屬離子的土壤環(huán)境里，其又會調(diào)節(jié)體內(nèi)金屬離子濃度，起到保護(hù)植物正常生長的作用。鑒于TaZIP29-7B蛋白在對重金屬脅迫下所展現(xiàn)的作用，TaZIP29-7B基因在今后小麥育種研究中，可以視其為一個在鹽脅迫方向能被重點利用的基因。如果更進(jìn)一步的深入研究ZIP轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)運機(jī)制及其在影響籽粒中金屬離子的積累規(guī)律，將有助于人們達(dá)到改善現(xiàn)有品種以富集金屬離子或降低植株對有害重金屬吸收和積累的目標(biāo)。