合作豬 IFN-β基因編碼區(qū)克隆及生物信息學(xué)分析

謝開(kāi)會(huì)，王 偉，楊姣姣，閆尊強(qiáng)，楊巧麗，滾雙寶,

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070；2. 甘肅省現(xiàn)代養(yǎng)豬工程技術(shù)研究中心，蘭州 730070)

干擾素(Interferon，IFN)是由宿主細(xì)胞對(duì)病原體如腫瘤細(xì)胞、病毒、細(xì)菌等作出反應(yīng)而產(chǎn)生的一組信號(hào)蛋白[1]。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和來(lái)源不同可分為3種：I 型、Ⅱ 型和 Ⅲ 型[2]，I型(病毒干擾素)包括IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-ω、IFN-κ、IFN-ε、IFN-ζ和IFN-τ；Ⅱ型(免疫干擾素)為IFN-γ；Ⅲ 型為IFN-λ，豬干擾素(Porcine interferon, PoIFN)包括 IFN- α、IFN-β、IFN-ω、IFN-ε、IFN-δ和 IFN- γ。

β型干擾素(Interferon-beta, IFN-β)主要由上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在病毒或其他類(lèi)型外來(lái)核酸的作用下產(chǎn)生[3]。IFN-β具有多種生物學(xué)功能：①免疫調(diào)節(jié)，IFN-β能夠增強(qiáng)MHC Ⅰ類(lèi)分子表達(dá)，但抑制MHC Ⅱ類(lèi)分子表達(dá)，而IFN-γ可促進(jìn) MHC Ⅱ類(lèi)分子表達(dá)，兩種干擾素相互協(xié)同，使機(jī)體的免疫應(yīng)答狀態(tài)達(dá)到最佳[4]；②抗腫瘤，有研究發(fā)現(xiàn)，IFN-β對(duì)多發(fā)性骨髓瘤[5]、肝細(xì)胞癌[6]、人腎上腺皮質(zhì)癌[7]等多種惡性腫瘤具有明顯的抑制和殺傷作用； ③抗病毒，PoIFN-β對(duì)豬偽狂犬病病毒(PRV)[8]、水泡性口炎病毒(VSV)、口蹄疫病毒(FMDV)[9]和豬傳染性胃腸炎病毒[10]有一定的抑制作用。目前，IFN-β基因已在虎[11]、犬[12]、雞[13]和水貂[14]等動(dòng)物上成功克隆，并且在一些豬品種(從江香豬[15]、新興豬[16]、巴馬豬[17]、梅山豬[18]和長(zhǎng)白豬[19])上也成功克隆，這些研究表明不同物種的IFN-β性質(zhì)和結(jié)構(gòu)有所不同，且在不豬種中IFN-β的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及氨基酸序列有微小差異，這些差異可能與豬的抗病性強(qiáng)弱有關(guān)。

合作豬又稱(chēng)蕨麻豬，其特有的基因型是其他豬種所不具備的，是中國(guó)重要的遺傳多樣性基因資源庫(kù)。目前，關(guān)于合作豬的研究主要集中在肉質(zhì)方面，李富強(qiáng)等[20]成功克隆了合作豬IFN-γ基因，但I(xiàn)FN-β基因在合作豬上鮮有研究。因此，本研究以合作豬耳組織cDNA為模板，克隆IFN-β基因的編碼區(qū)，通過(guò)生物信息學(xué)方法，分析IFN-β蛋白的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)及物種間的同源性和進(jìn)化關(guān)系，為深入研究豬IFN-β基因的生物學(xué)活性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品 采集合作豬耳組織樣本，液氮速凍，-80 ℃超低溫冰柜保存。

1.1.2 主要試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(6210A)和pMD19-T Vector購(gòu)自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209-02)和2×TaqMaster Mix、DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 在 NCBI/ GenBank中獲得豬IFN-β基因(登錄號(hào)：NM_001003923.1)序列，并用DNAMAN對(duì)基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物，F(xiàn)：5′-ATGGCTAACAAGTGCATCCTC-3′；R：5′-CAGTTCCGGAGGTAATCTGTA-3′，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 利用Trizol/氯仿法提取樣本的總RNA，并測(cè)定其OD值和質(zhì)量濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(6210A)說(shuō)明書(shū)將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存，備用。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，2×TaqMaster Mix 10 μL，無(wú)菌水6 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s， 72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸 10 min，4 ℃保存。

1.2.4 基因克隆及測(cè)序 PCR 產(chǎn)物經(jīng) 10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(180 V，35 min)。按照 DP209-02 凝膠回收試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，對(duì)目的片段進(jìn)行回收純化。將純化產(chǎn)物與 pMD19-T載體相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞上，反應(yīng)完成后，將菌液均勻涂抹于含有氨芐青霉素(AMP+)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)和異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取白色單菌落，加入到含有AMP+的100 mL LB液體培養(yǎng)基中，搖菌10 h，吸取 2 μL 用于菌液PCR，將菌液PCR產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.5IFN-β基因生物信息學(xué)分析 利用多種在線軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)克隆測(cè)序得到的IFN-β基因編碼區(qū)序列進(jìn)行分析(表1)；在NCBI/ GenBank中下載一些物種IFN-β的核酸序列：人(NM_002176)、家鼠(NM_010510)、牛(NM_174350)、獼猴(NM_001135795)、黑猩猩(XM_528553)、狗(NM_001135787)馬(M14546)、疣豬(JN391529)、梅山豬(AY687281)和巴馬豬(KJ147517.1)，用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn) 化樹(shù)。

表1 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能應(yīng)用的網(wǎng)站及軟件Table 1 Websites and softwares for predicting protein structure and function

2 結(jié)果與分析

2.1 合作豬 IFN-β基因PCR擴(kuò)增

以合作豬耳組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得特異性條帶約 561 bp (圖1)，與預(yù)期目的片段相符合。

M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000) DNA molecular mass standard(DL2000); 1.IFN-β基因PCR產(chǎn)物 PCR products ofIFN-βgene

圖1 合作豬IFN-β基因PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖
Fig.1 Electrophoretogram ofIFN-β
gene in Hezuo pig by PCR

2.2 測(cè)序結(jié)果分析

經(jīng)克隆測(cè)序后獲得合作豬IFN-β基因完整的CDS 區(qū)序列，長(zhǎng)度為561 bp，編碼186個(gè)氨基酸。該序列與參考序列的同源性為99.82%，且CDS區(qū)第177位點(diǎn)處的C突變?yōu)門(mén)(圖2)，但其編碼氨基酸沒(méi)有發(fā)生改變，為同義突變。

2.3 合作豬 IFN-β基因生物信息學(xué)分析

2.3.1 合作豬IFN-β基因同源性分析 使用Blast軟件分析合作豬IFN-β基因的同源性，結(jié)果如表2所示。使用MEGA 7.0軟件以合作豬、梅山豬、疣豬、牛和馬等的IFN-β核酸序列構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示，合作豬與梅山豬的親緣關(guān)系最近，其次為巴馬豬和疣豬(圖3)。

圖2 合作豬IFN-β核苷酸序列與參考序列比對(duì)Fig.2 Comparison of IFN-β nucleotide sequence in Hezuo pig and reference sequence

物 種Species 核酸序列相似性Nucleic acid sequence similarity氨基酸序列相似性Amino acid sequence similarity人 Homo sapiens(NM_002176)77.8864.71家鼠 Mus musculus(NM_010510)-46.24牛 Bos taurus(NM_174350)77.9859.68獼猴 Macaca mulatta(NM_001135795)77.8665.24黑猩猩 Pan troglodytes(XM_528553)77.7064.71狗 Canis lupus(NM_001135787)78.6462.37馬 Equus caballus(M14546)80.7166.13疣豬 Phacochoerus africanus(JN391529)98.7599.46梅山豬 Meishan pig(AY687281)99.82100巴馬豬 Bama pig(KJ147517.1)99.4798.39

圖3 IFN-β系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of IFN-β

2.3.2 合作豬IFN-β基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析 用ProtParam軟件預(yù)測(cè)合作豬IFN-β蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示合作豬IFN-β蛋白由186個(gè)氨基酸組成，分子式為C980H1551N253O289S14，分子質(zhì)量為21.95 ku ，理論等電點(diǎn)(PI)為4.93，消光系數(shù)(γ=280 nm)為 23 170，不穩(wěn)定系數(shù)為62.91，在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞中的半衰期為 30 h，平均疏水性為 -0.172，說(shuō)明該蛋白是不穩(wěn)定的酸性親水蛋白。氨基酸殘基中亮氨酸 (14.00%)和谷氨酸(9.10%)含量較高(圖4)，帶負(fù)電荷的天冬氨酸殘基(Asp) 和谷氨酸殘基(Glu)為25個(gè)，帶正電荷的精氨酸殘基(Arg)和賴氨酸殘基(Lys)為18個(gè)。

圖4 合作豬IFN-β蛋白中各氨基酸的組成Fig.4 Composition of various amino acids in IFN-β protein of Hezuo pig

2.3.3 合作豬IFN-β基因編碼蛋白親水性/疏水性分析 利用ProtScale軟件對(duì)合作豬IFN-β的親/疏水性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示大部分氨基酸為負(fù)值，親水性氨基酸為62.90%，疏水性氨基酸為37.10%，第9和10位氨基酸分值最高為2.567，第71位氨基酸分值最低為 -2.422(圖5)。

2.3.4 合作豬IFN-β基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析 使用TMHMM Server v.2.0分析合作豬IFN-β蛋白跨膜區(qū)域，結(jié)果顯示，該蛋白有1個(gè)跨膜區(qū)域，屬于跨膜蛋白(圖6)。

2.3.5 合作豬IFN-β基因編碼蛋白信號(hào)肽分析 利用SignalP 4.1進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，信號(hào)肽酶切位點(diǎn)分值(C)為0.796，剪切位點(diǎn)分值(Y)為0.838，信號(hào)肽(S)分值為0.947，S>0.5，說(shuō)明該蛋白含有信號(hào)肽，前21個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列(圖7)。

圖5 合作豬IFN-β蛋白的疏水性Fig.5 Hydrophobicity of IFN-β protein in Hezuo pig

圖6 合作豬IFN-β蛋白的跨膜區(qū)域Fig.6 Transmembrane domain of IFN-β protein in Hezuo pig

圖7 合作豬IFN-β蛋白的信號(hào)肽Fig.7 Signal peptide of IFN-β protein in Hezuo pig

2.3.6 合作豬IFN-β基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域分析 采用SMART軟件對(duì)合作豬IFN-β蛋白進(jìn)行分析。結(jié)果表明，該蛋白在58～174位氨基酸處存在一個(gè)IFabd結(jié)構(gòu)域(圖8)。

圖8 IFN-β 的 SMART 結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.8 Structural prediction of IFN-β in SM ART

2.3.7 合作豬IFN-β基因編碼蛋白亞細(xì)胞定位 采用PSORT II軟件對(duì)合作豬IFN-β蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明，合作豬IFN-β蛋白分布在細(xì)胞外、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和囊泡的可能性分別為66.70%、11.10%、11.10%和11.10%。

2.3.8 合作豬IFN-β基因編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 采用SOPMA在線軟件對(duì)合作豬IFN-β蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，合作豬IFN-β蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由75.81%的α-螺旋、1.61%的伸展鏈、2.69%的β-轉(zhuǎn)角和19.89%的無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成(圖9)。

h.α- 螺旋 Alpha helix;e.伸展鏈V Extend strand;t.β- 轉(zhuǎn)角 Beta bridge;c.無(wú)規(guī)則卷 Random coil

2.3.9 合作豬IFN-β基因編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 采用在線軟件 SWISS-MODEL 對(duì)合作豬IFN-β蛋白進(jìn)行同源建模，預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由 α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成(圖10)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)基本 一致。

3 討 論

干擾素是一類(lèi)能誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生多種廣譜抗病毒蛋白的細(xì)胞因子，具有阻止病毒繁殖、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)等生物學(xué)功能[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，在干擾素中，IFN-β對(duì)重癥急性呼吸綜合征(SARS)病毒抑制效果最強(qiáng)，治療效果更好[22]。IFN-β還可以抑制甲型流感病毒的增殖，感染細(xì)胞的初期使用 IFN-β，能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生 IFN-α，間接地增強(qiáng)細(xì)胞抵御病毒進(jìn)一步感染的能力[23]，可以作為一種良好的生物制劑。本研究以合作豬耳組織的cDNA為模板，克隆測(cè)序得到其IFN-β基因的CDS區(qū)，序列全長(zhǎng)為561 bp，編碼186個(gè)氨基酸，與參考序列(登錄號(hào)：NM_001003923.1)基本一致，合作豬IFN-β僅在CDS區(qū)的第177位點(diǎn)處發(fā)生突變(C→T)，而其編碼氨基酸沒(méi)有發(fā)生改變，屬于同義突變，這表明IFN-β的核酸序列和氨基酸序列在不同品系豬中具有高度的保守性。

本研究中，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，合作豬IFN-β蛋白包括含有21個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽序列和165個(gè)氨基酸殘基的成熟多肽序列，這與已經(jīng)證實(shí)的豬IFN-β信息一致[24]。分子質(zhì)量為21.95 ku，與已克隆巴馬豬的分子質(zhì)量(22 ku)基本一致，但低于人IFN-β的分子質(zhì)量(23 ku)，理論等電點(diǎn)(PI)為4.93，為酸性蛋白。蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為62.91，大于40，屬于不穩(wěn)定蛋白。疏水性分析發(fā)現(xiàn)，IFN-β蛋白中親水性氨基酸為 62.90%，疏水性氨基酸為37.10%，在維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中起重要作用。該蛋白在58～174位氨基酸處存在一個(gè)結(jié)構(gòu)域：IFabd (Interferon alpha, beta and delta) 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是IFN家族的特征結(jié)構(gòu)域，為細(xì)胞因子受體結(jié)合區(qū)域，其通過(guò)與細(xì)胞表面的受體相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞活性，激活各種信號(hào)通路，參與抗病毒和免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)[25]。同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，合作豬IFN-β的核酸序列與巴馬豬、梅山豬和疣豬的同源性為99.47%、99.82%和98.75%，氨基酸序列的同源性為 98.39%、100%和99.46%，合作豬IFN-β的第13、43和68位氨基酸分別為甲硫氨酸(Met)、谷氨酸(Glu)和脯氨酸(Pro)，巴馬豬的第13、43和68位氨基酸分別為纈氨酸(Val)、甘氨酸(Gly)和絲氨酸(Ser)，說(shuō)明不同豬種的IFN-β有微小差異，這些差異是否決定豬的抗病性強(qiáng)弱，還需深入研究。有研究發(fā)現(xiàn)，人IFN-β第42位或43位谷氨酸發(fā)生突變時(shí)，使IFN-β 部分或全部功能喪失[26]，而且Glu 43 被認(rèn)為是重要功能抗原表位的一部分。本研究分析發(fā)現(xiàn)合作豬IFN-β蛋白序列的第43位為Glu，再次證明IFN-β在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。分子進(jìn)化樹(shù)也表明，合作豬與梅山豬親緣關(guān)系最近，與家鼠親緣最遠(yuǎn)，說(shuō)明IFN-β具有種屬特異性。IFN-β在蛋白結(jié)構(gòu)上屬于螺旋型細(xì)胞因子家族成員，這與合作豬IFN-β蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致，其主要包含5個(gè)α-螺旋 (75.81%)。

干擾素是第一個(gè)被克隆化，并用與臨床疾病治療的細(xì)胞因子[27]。有關(guān)研究表明，將細(xì)胞因子與保護(hù)性抗原基因共表達(dá)而研制成的基因工程制劑，是提高機(jī)體免疫效果，抑制病毒在機(jī)體內(nèi)表達(dá)的有效手段之一[28]。本研究對(duì)合作豬IFN-β基因的編碼區(qū)進(jìn)行克隆和序列分析，為進(jìn)一步研究IFN-β基因的生物活性奠定基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)研究IFN-β在豬免疫系統(tǒng)和抗病毒方面的影響具有重要價(jià)值。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)合作豬IFN-β基因CDS區(qū)全長(zhǎng)為561 bp，編碼186個(gè)氨基酸，編碼蛋白屬于干擾素ab超家族，是不穩(wěn)定的酸性親水性蛋白，含有信號(hào)肽和跨膜區(qū)，屬于分泌蛋白。