枯草芽孢桿菌Bs-W5的生防作用研究

王 琳, 李璐璐, 劉瑞瑞, 李志英

(1.西安醫(yī)學院 醫(yī)學技術(shù)系, 陜西 西安 710021; 2.西部生物資源與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點實驗室, 陜西 西安 710069)

在當代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，植物病原微生物是農(nóng)作物減產(chǎn)的主要原因之一[1]，所以對植物病原物的防治也顯得尤為重要。在以前，人們經(jīng)常使用化學農(nóng)藥來達到防治的目的，雖然這取得了不錯的效果，但是也給環(huán)境和人民的健康帶來了潛在的威脅，同時也讓病原微生物有了抗性，產(chǎn)生了更多的環(huán)境問題。近年來，隨著綠色環(huán)保的倡議越來越多，對植物病害防治有顯著效果的生物防治也就脫穎而出，而其較于其他方式來說更加安全，零殘留，零污染，并且還具有生產(chǎn)成本低，不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點[2]?？股睾椭参镎T導(dǎo)劑以及拮抗微生物等都是生物防治劑，其中微生物的種類主要有細菌，真菌，放線菌和病毒等[3]。用來進行生物防治的細菌主要有芽胞桿菌、假單胞桿菌和巴氏桿菌等[4]，其中芽孢桿菌由于其產(chǎn)生的芽孢具有耐熱、耐旱、抗紫外線的優(yōu)點，成為生防研究的重要菌種資源。芽孢桿菌種群龐大，繁殖能力強，對營養(yǎng)和環(huán)境要求低，在自然界廣泛分布，對環(huán)境無危害，容易分離培養(yǎng)，抑菌譜廣泛，在儲存、制作菌劑和運輸方面都有著極強的優(yōu)勢?，F(xiàn)在用來進行生物防治的芽孢桿菌有巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、短小芽孢桿菌(Bacillus Pumilus)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)等。

枯草芽孢桿菌大量存在于土壤和變質(zhì)的有機物中，且不止存在于植物的根、莖、葉的表面[5]，其根部和莖部組織內(nèi)也存在著內(nèi)生性芽孢桿菌?？莶菅挎邨U菌具有抑菌譜廣泛、營養(yǎng)要求簡單、繁殖能力強，還可以形成芽孢等優(yōu)點，在菌劑開發(fā)方面有著極大的優(yōu)勢。目前，國內(nèi)外已經(jīng)對枯草芽孢桿菌的生防菌種展開了大量的研究，并且取得了很大的成果，已經(jīng)有商品化的枯草芽孢桿菌菌劑上市。

1 實驗材料與試劑

1.1 菌種

表1 菌株情況

注:*“本實驗室”指西部生物資源與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點實驗室。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，瓊脂16 g，自然pH值。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂16 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

2 實驗方法

2.1 枯草芽孢桿菌Bs-W5菌落對植物病原菌抑菌活性測定

2.1.1 Bs-W5和植物病原菌的活化 在做抑菌實驗前首先要對Bs-W5和植物病原菌進行活化。Bs-W5活化：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，30℃，30 h；真菌病原體活化：PDA培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)至菌落被一半平板覆蓋；細菌病原體活化：牛肉蛋白胨培養(yǎng)基，30℃，24 h?；罨瓿芍螅瑢s-W5、真菌病原體以及細菌病原體接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 h，然后將其稀釋為不同的濃度以備后續(xù)使用[6]。

2.1.2 平板菌落對峙法 筆者研究使用平板菌落對峙法來測定枯草芽孢桿菌Bs-W5對植物病原菌的抑制活性[7]。測定方法：在配置好的PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿底部找到中心點，然后在其上劃十字線，將直徑為6 mm的病原菌菌餅接種到中心；將Bs-W5單菌落接種到距離中心30 mm的3個方向，剩余一個方向不接種Bs-W5菌落用作空白對照。在PDA培養(yǎng)基中心接種病原菌而在其他地方不接種Bs-W5來作為對照組。在對照組的病原菌鋪滿整個培養(yǎng)基平板時，再測量實驗組中Bs-W5對不同致病菌的拮抗寬度。每組試驗做3個重復(fù)。

2.1.3 抑制率的計算方法

抑制菌絲生長率(%)

2.2 Bs-W5發(fā)酵液上清液對植物病原菌的抑制活性測定

2.2.1 Bs-W5發(fā)酵液上清液的制備和植物病原菌的活化 發(fā)酵液上清液的制備：將在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上活化后的菌株Bs-W5接種3環(huán)到種子培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)22 h(30℃)。然后以5%的接種量接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中(錐形瓶裝液量100 mL·250 mL-1)，30℃，180 r·min-1搖瓶培養(yǎng)72 h，收集發(fā)酵液，12 000 r·min-1高速離心10 min，收集上清液，最后將收集到的上清液用0.22 μm無菌微孔濾膜過濾器進行過濾[9]，最后保存以備后續(xù)使用。

植物病原菌的活化：同2.1.1的植物病原菌活化。

2.2.2 牛津杯法 筆者研究使用牛津杯法來測定Bs-W5發(fā)酵液上清液幾種植物病原菌的抑制活性[10]。測定方法：在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)皿底部找到中心點之后劃出十字線，在中心點接種直徑為6 mm的病原菌菌餅，在距離中心30 mm處分別放置4個不同方向的牛津杯，在其中3個牛津杯中加入200 μL的發(fā)酵液上清液，在剩余一個牛津杯中加入200 μL無菌水作為對照。只在PDA培養(yǎng)基底部的中心接種病原體真菌餅的一組作為空白對照。在對照組的菌落鋪滿整個平板的時候，測量拮抗距離。每個實驗三個重復(fù)。

2.2.3 抑制率 計算方法同2.1.3。

2.3 不同處理條件對發(fā)酵液上清液抑菌率穩(wěn)定性的影響

使用不同條件處理Bs-W5的發(fā)酵液上清液來測定其抑菌率的穩(wěn)定性，其中包括貯存穩(wěn)定性試驗、熱穩(wěn)定性試驗、酸堿穩(wěn)定性試驗、光照穩(wěn)定性試驗和遺傳穩(wěn)定性試驗[11]。測定抑菌率試驗的植物病原菌選用抑菌率較大(53.98%)且生長較快(4 d長滿整個平板)的葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)，測定的方法選用牛津杯法。抑菌率的計算方法同2.1.3。

2.3.1 貯存穩(wěn)定性試驗 將之前備用的發(fā)酵液上清液(100 mL)取出，分成5等份，依次編號1，2，3，4和5，并以密封形式儲存。在密封放置15 d的時候，開始測定1號上清液的抑菌率，30 d的時候測定2號上清液的抑菌率，60 d的時候測定3號上清液的抑菌率，以此類推[12]。使用沒有任何處理的新鮮的發(fā)酵液上清液作為對照組。每組試驗3次重復(fù)。

2.3.2 熱穩(wěn)定性試驗 將之前備用的發(fā)酵液上清液(100 mL)取出，分成5等份，依次編號1，2，3，4和5。1～4號分別在40℃、60℃、80℃、100℃的條件下分別處理60 min，將編號為5的樣品于120℃下處理20 min，冷卻至室溫，最終測定1～5號的抑菌率。使用沒有任何處理的新鮮的發(fā)酵液上清液作為對照組。每組試驗3次重復(fù)。

2.3.3 酸堿穩(wěn)定性試驗 取13等份20 mL的發(fā)酵液上清液，將其分別編號為1～13號。調(diào)節(jié)相應(yīng)的pH值(1 mol·L-1的HCl和1 mol·L-1的NaOH溶液)，處理12 h之后，再將pH值調(diào)節(jié)為初始的值(pH值為8)，并測定用不同pH值處理之后的上清液的抑制率。使用沒有任何處理的新鮮的發(fā)酵液上清液作為對照組。每組試驗3次重復(fù)。

2.3.4 光照穩(wěn)定性試驗 取5等份20 mL的發(fā)酵液上清液，分別編號1、2、3、4、5號，多波段光照培養(yǎng)箱的光照強度設(shè)置為4 500±500 lx，然后以1～5號的順序分別在光照培養(yǎng)箱中照射2、4、6、8、10 d后，分別測定每組的抑菌率。使用沒有任何處理的新鮮的發(fā)酵液上清液作為對照組。每組試驗3次重復(fù)。

2.3.5 遺傳穩(wěn)定性試驗 第一代菌種：活化之后的枯草芽孢桿菌Bs-W5[13]；第二代菌種：活化之后再培養(yǎng)20 h后，轉(zhuǎn)接到新的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌種，依此類推，培養(yǎng)10代。將2，4，6，8和10代的菌株通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)72 h(12 000 r·min-1，10 min)之后，將收集到的上清液用0.22 μm無菌微孔濾膜過濾器進行過濾[14]，最后測出發(fā)酵液上清液的抑菌率。第一代菌株的發(fā)酵液上清液為對照組，每組3次重復(fù)。

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 Bs-W5菌落對不同植物病原菌的抑制作用

在測定菌落對不同植物病原菌的抑制作用時采用的平板菌落對峙法可以直觀的反映出拮抗菌的拮抗能力[15]。平板菌落對峙法可以在平板上清晰的觀察到抑菌圈及拮抗寬度，是一種操作簡單、實用性強的拮抗測定方法。Bs-W5對不同致病菌的抑制率如表2所示。

表2 Bs-W5對不同病原菌的抑制率

由表2得出，Bs-W5對九種植物病原真菌和兩種病原細菌都有比較強烈的拮抗作用。而上述幾種拮抗作用中，Bs-W5對番茄灰霉病菌的拮抗作用達到了71.02%，對腐皮鐮刀菌的拮抗作用達到65.88%，是對九種病原真菌中拮抗能力最強的。而對其他的病原真菌的抑制率也都高于50%。在對兩種病原細菌的拮抗作用中，Bs-W5對金黃色葡萄球菌的拮抗作用比大腸桿菌的要強一些。上述研究表明枯草芽孢桿菌Bs-W5不只可以對植物病原真菌有著較強的拮抗作用，也對部分病原細菌存在拮抗作用。

枯草芽孢桿菌Bs-W5對部分植物病原菌的拮抗效果如下圖所示。

圖1 枯草芽孢桿菌Bs-W5對楊樹潰瘍病菌的抑制作用

圖2 枯草芽孢桿菌Bs-W5對葡萄座腔菌的抑制作用

圖3 枯草芽孢桿菌Bs-W5對甜瓜枯萎病原菌的抑制作用

圖4 枯草芽孢桿菌Bs-W5對蘋果斑點落葉病原菌的抑制作用

圖5 枯草芽孢桿菌Bs-W5對番茄灰霉病菌的抑制作用

圖6 枯草芽孢桿菌Bs-W5對黑曲霉的抑制作用

圖7 枯草芽孢桿菌Bs-W5對米曲霉菌的抑制作用

圖8 枯草芽孢桿菌Bs-W5對金黃色葡萄球菌

從以上Bs-W5菌落在PDA平板上對不同病原菌的拮抗圖可以看到，無論是在培養(yǎng)基的表面還是在培養(yǎng)基內(nèi)部，Bs-W5對不同病原菌都有較為強烈的抑制作用。同時也可以觀察到枯草芽孢桿菌Bs-W5具有很強的繁殖能力，在PDA平板上形成的菌落很大，說明Bs-W5不僅可以分泌抗菌物質(zhì)對病原菌形成抑制作用，而且在生存空間和營養(yǎng)方面對病原菌也有著很強的競爭作用。

3.2 枯草芽孢桿菌Bs-W5發(fā)酵液上清液對不同植物病原菌的抑制作用

發(fā)酵液的上清液中存在著菌體生長過程中分泌的各種物質(zhì)，其中Bs-W5分泌的各種抑菌物質(zhì)對其抑菌作用起著重要作用，而發(fā)酵液上清液中抑菌物質(zhì)的拮抗性的測定則使用的是牛津杯法[16]。結(jié)果如表3所示。

由表3得出，Bs-W5發(fā)酵液上清液對植物病原菌的抑制作用也較為強烈，其中對番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)的抑制作用達到了66.26%，是上述幾種抑菌作用中最強的，而表2中運用平板菌落對峙法所測得的結(jié)果也是對番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)的抑制作用最強，其次對葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)的抑制作用較好，為53.98%。兩種抑制方式相比，Bs-W5發(fā)酵液上清液的抑制率低于菌落的抑制率。這表明Bs - W5發(fā)酵液上清液的抑菌能力弱于菌落，這意味著雖然上清液中有抗菌物質(zhì)，但是因為平板菌落對峙法中菌落不僅分泌抗菌物質(zhì)，而且也對病原真菌形成一種生物競爭作用，所以兩種抑制機制的共同作用下，使得菌落的抑菌性更強。

牛津杯法對部分植物病原菌的抑制作用如下所示。

表3 Bs-W5發(fā)酵液上清液對植物病原菌的抑制率

圖9 Bs-W5發(fā)酵上清液對葡萄座腔菌 的抑制作用

圖10 Bs-W5發(fā)酵上清液對蘋果腐爛菌的抑制作用

圖11 Bs-W5發(fā)酵上清液對腐皮鐮刀菌的抑制作用

圖12 Bs-W5發(fā)酵上清液對楊樹潰瘍病菌的抑制作用

圖13 Bs-W5發(fā)酵上清液對甜瓜枯萎病的抑制作用

圖14 Bs-W5發(fā)酵上清液對番茄灰霉病菌的抑制作用

上述圖片表明，Bs-W5的發(fā)酵液上清液對植物病原菌有著較強的抑制作用。所以，不僅可以利用發(fā)酵液中的活細菌和孢子來進行生物防治，還可以將上清液當中的拮抗物質(zhì)用于生物防治。

3.3 不同條件處理對發(fā)酵液上清液抑菌率穩(wěn)定性的影響

(1)貯存穩(wěn)定性。由于枯草芽孢桿菌Bs-W5發(fā)酵液上清液中的拮抗物質(zhì)主要成分為蛋白質(zhì)，所以如果放置時間過長的話就會發(fā)生蛋白質(zhì)變性或者沉淀等問題，以至于其抑菌作用也會受到相應(yīng)的影響。所以對其發(fā)酵液上清液的貯存穩(wěn)定性的試驗是有必要的，試驗結(jié)果如圖15所示。

圖15 存放時間對Bs-W5發(fā)酵液上清液抑菌率的影響

由圖15得出，Bs-W5發(fā)酵液上清液存放的前15 d，對其抑菌率沒有明顯影響，存放30 d之后，其抑菌率就開始下滑。在30～60 d的這段時間抑菌率降低最明顯，60 d之后抑菌率不到原來的一半。當存放天數(shù)達到180 d的時候，菌株發(fā)酵液上清液的抑菌性幾乎消失。這就說明當存放天數(shù)超過15 d后，發(fā)酵液上清液的抑菌性就開始逐漸的降低，直至最后幾乎沒有抑菌作用。這可能是因為15 d之后抑菌蛋白開始出現(xiàn)變性、沉淀等現(xiàn)象，使得抑菌物質(zhì)的活性降低，導(dǎo)致上清液的抑菌率穩(wěn)定性發(fā)生變化。

(2)熱穩(wěn)定性試驗。不同溫度處理之后的發(fā)酵液上清液的抑菌率如圖16所示。

圖16 不同溫度對Bs-W5發(fā)酵液上清液的抑菌率的影響

由圖16得出，在40℃的條件下處理過后，和對照組的抑菌率幾乎無差別，當處理溫度超過40℃，發(fā)酵液上清液的抑菌率開始下降，超過80℃之后抑菌率迅速下降，直到溫度達到120℃的時候，上清液當中的抑菌率為0%。由此可見，發(fā)酵液上清液中的抑菌物質(zhì)不耐高溫，保存時要注意溫度的控制。

(3)酸堿穩(wěn)定性。酸堿穩(wěn)定性試驗可以了解Bs-W5發(fā)酵液上清液中的抑菌物質(zhì)對酸堿的耐受程度，來防止在提取分離的步驟中使用了不當?shù)膒H值而使抑菌物質(zhì)失活，這對以后抗菌物質(zhì)提取、分離、純化以及鑒定都有著重大意義[17]。不同pH值處理過的上清液的抑菌率如圖17所示。

圖17 不同pH值對Bs-W5發(fā)酵液上清液抑菌率的影響

由圖17得出，Bs-W5發(fā)酵液上清液在pH值為7～9時，抑菌率一直保持較高水平。當pH值為9～11時，上清液的抑菌率隨pH值的升高而降低。當pH值超過11時，上清液中的拮抗物質(zhì)在堿性條件下變性失活而使抑菌率迅速的下降。而當pH值低于7時，上清液的抑菌率隨著pH值的減小而減小，同時上清液當中存在少量的沉淀物質(zhì)。這可能是因為在酸性條件下，上清液中的拮抗物質(zhì)形成了不可溶性沉淀所致[18]。

(4)光照穩(wěn)定性。研究抗菌物質(zhì)的所有過程都是在有光照的條件下進行，所以要對Bs-W5的光照穩(wěn)定性進行試驗，以便后續(xù)試驗得出更加準確的結(jié)果[19]。不同光照時間對上清液的抑菌率影響如圖18所示。

圖18 光照天數(shù)對Bs-W5發(fā)酵液上清液抑菌率的影響

由圖18得出，在經(jīng)過長時間光照照射之后，抑菌率比較穩(wěn)定，依然保持在原有水平。這就說明Bs-W5所分泌的抗菌物質(zhì)是不受光照影響的[20]，可以在大田試驗中直接施用，而不必擔心光照所帶來的影響。

(5)遺傳穩(wěn)定性。Bs-W5作為一株生防菌種，則其必須具有抑菌性能遺傳穩(wěn)定性，以防止在使用過程中出現(xiàn)變異等情況，使得其抑菌性能受到影響。其遺傳穩(wěn)定性如圖19所示。

圖19 傳代次數(shù)對Bs-W5發(fā)酵液上清液抑菌率的影響

從圖19的結(jié)果可以看到，在Bs-W5傳代10代培養(yǎng)的過程中，其發(fā)酵液上清液的抑菌率保持較高的穩(wěn)定性，這就說明菌種枯草芽孢桿菌Bs-W5有著很好的遺傳穩(wěn)定性，值得以后繼續(xù)深入的研究，以充分發(fā)掘其生防能力[21]。