“南海Ⅰ號”船體發(fā)掘期間的微生物防治

陳 岳（中國文化遺產(chǎn)研究院 北京 100029）

杜 靖（中國文化遺產(chǎn)研究院 北京 100029）

潘 皎（南開大學 天津 300071）

一、“南海Ⅰ號”船體發(fā)掘與保護

“南海Ⅰ號”沉船是迄今為止我國發(fā)現(xiàn)的保存最為完整的古代大型遠洋船舶。2007年，“南海Ⅰ號”沉船被成功整體打撈出水。后連同打撈沉箱移入陽江市海陵島廣東海上絲綢之路博物館內(nèi)，浸沒保存于“水晶宮”中。2013年，“南海Ⅰ號”考古發(fā)掘和文物保護工作正式啟動，在博物館室內(nèi)采用飽水發(fā)掘法，逐層降低“水晶宮”的水位，自上而下順序發(fā)掘沉箱內(nèi)的遺存。發(fā)掘階段的文物保護工作主要配合考古作業(yè)，開展出水文物的現(xiàn)場穩(wěn)定性保護。

隨著發(fā)掘工作的逐步推進，埋藏在海底淤泥和凝結物中的“南海Ⅰ號”木質船體慢慢暴露出來。到本文撰寫時，船體內(nèi)側已基本展現(xiàn)出來，外側淤泥也按計劃開始清除（圖1）。在“水晶宮”水位降低后，高出水位的遺址部分由于失水容易發(fā)生硬化、干裂、收縮，從而對船體造成破壞；而已經(jīng)從淤泥中發(fā)掘出的船體部分，暴露在空氣中也極易失水干燥，進而會發(fā)生收縮、變形，甚至產(chǎn)生斷裂和塌陷。為妥善保存“南海Ⅰ號”木質船體，防止這類病害損傷的發(fā)生，文物保護工作者在發(fā)掘過程中通過多種方式，對遺址和暴露出的船體木質構件開展了長期持續(xù)的保濕工作。由最初采用人工噴淋作業(yè)的方式，到逐步建立起固定式噴淋系統(tǒng)，再根據(jù)考古發(fā)掘工作的需要搭建了天車移動噴淋系統(tǒng)，并對天車移動噴淋系統(tǒng)進行了多次升級改造，有效保障了船體保濕工作的進行（圖2）。

二、船體微生物病害

廣東海上絲綢之路博物館所處陽江市海陵島氣候溫暖，夏季氣溫高。館內(nèi)考古發(fā)掘現(xiàn)場環(huán)境空氣濕度常年維持在70%RH以上，最高可達97.8%RH。在文物保護工作開展初期，曾采取用宣紙、無紡布對船木進行覆蓋和用塑料膜對船木進行包裹的方式進行保濕。這樣的環(huán)境條件和保護措施有利于木質船體的保護，同時也有利于微生物的生長。為了防止木質船體發(fā)生霉變、降解等微生物病害，在對“南海Ⅰ號”進行保濕噴淋工作的初期，保護工作者在噴淋液中加入了硼酸、硼砂作為防霉劑。

在后續(xù)“南海Ⅰ號”沉船現(xiàn)場保護工作實施過程中，在木質船體表面發(fā)現(xiàn)了一些白色粉末狀、絮狀物質（圖3）。這些白色物質呈區(qū)片狀，廣泛分布于船體各區(qū)域，且隨時間推移其分布區(qū)域和面積有增加的趨勢。

對這些白色物質進行提取，并在4℃條件下保存至實驗室，進行顯微鏡觀察。結果發(fā)現(xiàn)少量樣品在顯微鏡下呈顆粒狀，無明顯菌絲狀的微生物，應該是由船木中析出的海鹽類物質；而大部分樣品在顯微鏡下有明顯的呈菌絲狀微生物細胞，菌絲直徑為7-10μm，判斷為真菌（圖4）。由此可知，硼酸、硼砂對此種微生物沒有起到有效的抑制作用。為了明確微生物病害情況，開展有針對性的治理措施，對滋生于“南海Ⅰ號”木質船體表面的微生物進行了取樣分析。

三、微生物檢測分析

為盡可能揭示“南海Ⅰ號”木質船體表面的微生物群落組成，微生物檢測分析采用了克隆文庫和高通量測序相結合的方法。

（一）樣品采集

用手術刀刮取微生物樣品放在滅菌離心管，然后立即放置在加有冰塊的保溫桶內(nèi)保存至實驗室。

（二）DNA提取

選用MO BIO公司的“土壤DNA提取試劑盒”（PowerSoil DNA Isolation Kit），對“南海Ⅰ號”船體樣品進行前處理并提取樣品總DNA。

（三）克隆文庫

細菌選用擴增細菌1 6 s r D N A的通用引物341f-907r，真菌選用擴增真菌18s rDNA的通用引物ITS1-ITS4：

341f：5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’

907r：5’-CCCCGTCAATTCATTTGAGTTT-3’

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

PCR反應條件為，反應體系：模板2μL，10×Taq酶buffer 2.5μL，dNTP（2.5mM）2μL，引物（10μM）各1μL，Taq酶（5U/μL），加滅菌ddH2O至25μL。條件：94℃預變性3min，94℃變形30s，54℃復性30s，72℃延伸40s，30個循環(huán)；最終72℃延伸10min。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，將得到的PCR產(chǎn)物均采用OMEGA公司DNA Gel Extraction Kit進行純化回收。

依照TaKaRa公司提供的pBackZero-T Vector Cloning Kit載體建立連接體系：PMD19-T vector 1μL（50ng/μL），solution I 5μL，PCR產(chǎn)物84ng，滅菌去離子水加至10μL，16℃金屬浴12h。感受態(tài)細胞為TaKaRa公司提供的Escherichia coli DH5α菌株，轉化，將細胞均勻涂布在含氨芐青霉素（終濃度100μg/mL）的固體LB培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。

隨機挑取克隆文庫中白色菌落，每份樣品挑取20～40個克隆，進行菌落PCR，驗證其是否為正確的轉化子，同時點備板放到37℃進行培養(yǎng)，把正確的轉化子進行測序。菌落PCR中，細菌使用引物341f-907r，真菌使用引物ITS1-ITS4。

（四）高通量測序

將點好的轉化子平板進行測序，獲得的序列與GenBank比較，根據(jù)數(shù)據(jù)庫中同源序列判斷所得序列的種屬。統(tǒng)計每份樣品獲得的微生物序列的次數(shù)，判斷樣品所感染的主要微生物種類，采用以下標準（S：待測序列與數(shù)據(jù)庫中序列相似度）：

細菌16s rDNA：S≥97%，同種；85＜S＜97%，同屬。

真菌ITS：S≥99%，同種；95＜S＜99%，同屬。

四、檢測結果與討論

（一）克隆文庫結果

N H I-1號樣品的原核生物中，芽孢桿菌屬（Bacillus）占總克隆數(shù)比例為72%，是主要原核致病菌，其次是硫桿菌屬(Filobacillus)占總克隆數(shù)比例為25%，其余未知的克隆占比相對較低。NHI-1號樣品的真核生物中，鐮刀菌屬（Fusarium）占總克隆數(shù)比例97%，是主要真菌致病菌。

N H I-2號樣品的原核生物中，海源菌屬(Idiomarina）占總克隆數(shù)比例為67%，是主要原核致病菌，其余的克隆占比相對較低。NHI-2號樣品的真核生物中，鐮刀菌屬（Fusarium）占比例為97%，是主要真菌致病菌。

（二）高通量測序結果

N H I-1號樣品的原核生物中，鹽單胞菌屬（Halomonas）占細菌總數(shù)的14%，未知菌占細菌總數(shù)的72%，其余種屬占比相對較低。NHI-1號樣品的真核生物中，鐮刀菌屬（Fusarium）占比為97%，為主要真菌致病菌。

N H I-2號樣品的原核生物中，海源菌屬(Idiomarina）占細菌總數(shù)的26%，是主要原核致病菌，其次是鹽單胞菌屬（Halomonas）占細菌總數(shù)的12%，未知菌占比為40%。NHI-2號樣品的真核生物中，鐮刀菌屬（Fusarium）占比為97%，是主要真菌致病菌。

（三）結果討論

無論是克隆文庫測序還是高通量測序的結果，NHI-1及NHI-2的主要病害真菌都是鐮刀菌屬（Fusarium），且在克隆文庫測序與高通量測序結果中所占的比例相同，都是97%。在細菌方面，NHI-2樣品在兩種方法的測試結果中都是海源菌屬(Idiomarina）所占比例最大；而NHI-1樣品在克隆文庫測序結果中較多的是芽孢菌屬（Bacillus），在高通量測序結果中除去未知菌外，最多的是鹽單胞菌屬（Halomonas）。

其中鐮刀菌在土壤和各種有機質等環(huán)境中廣泛分布，可以降解木材中的纖維素、木質素和木聚糖，為木材危害很大。鐮刀菌屬中腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）可以產(chǎn)纖維素酶[1][2]。Lozovaya等人的研究表明腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）在感染大豆根部的過程可降解木質素，而且孢子萌發(fā)過程中產(chǎn)生的細胞壁降解酶可促進其侵染效率[3][4]。NORRIS從木材中分離到的腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）可分解芳香酸和木質素[5]。Saparrat等人的研究表明腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）可以產(chǎn)低活性胞外MnP和MIP兩種與木質素降解有關的酶[6]。此外，降解木質素過程中的關鍵酶漆酶在腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）中也有發(fā)現(xiàn)[7][8]。鐮刀菌屬中的尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）除了能產(chǎn)生纖維素酶之外，還能產(chǎn)生木聚糖酶[9][10]。

五、微生物治理效果

通過對“南海Ⅰ號”木質船體上的微生物開展檢測分析，可以了解到其中最主要的病害微生物是鐮刀菌，其對船體木材的安全保存威脅最大，應作為主要治理對象。

通過對相關微生物抑制劑的篩選，發(fā)現(xiàn)采用復配的異噻唑啉酮對鐮刀菌的抑制效果最好（圖5），且其具有廣譜性、高效性及環(huán)境友好性等優(yōu)點，對人體無害，適合用于考古發(fā)掘現(xiàn)場。

之后，在“南海Ⅰ號”木質船體保護工作中，向船體噴淋保濕液中添加了復配的異噻唑啉酮溶液，以此對船體的微生物病害開展治理。分別在開展治理后6個月和12個月進行觀察，明顯可見白色菌斑逐步消退（圖6）。進一步分析結果也顯示鐮刀菌屬在木質船體表面微生物群落中占比明顯降低。

結語

“南海Ⅰ號”獨特的發(fā)掘方式和保存環(huán)境是造成其產(chǎn)生鐮刀菌病害的主要原因。海洋出水沉船往往采用水下考古作業(yè)的方式進行發(fā)掘，在被打撈出水后也多采用浸沒保存的方式。在這個過程中，沉船木材絕大部分時間與空氣隔絕，從而不利于鐮刀菌的生長?！澳虾＂裉枴背链目脊虐l(fā)掘環(huán)境溫暖高濕，有利于鐮刀菌的生長，船體木材中的纖維素、木質素、木聚糖等成分又為鐮刀菌提供了養(yǎng)料。這些因素共同造成了微生物病害的產(chǎn)生。通過鑒別致病微生物種類，篩選具有針對性的抑菌劑，“南海Ⅰ號”船體的微生物病害得到了有效治理。下一步，應合理控制抑菌劑用量防止病菌產(chǎn)生耐藥性，同時開展備用抑菌劑的篩選工作，以保障“南海Ⅰ號”木質船體的長期安全保存。