白果內(nèi)酯對(duì)大鼠心肌抗氧化機(jī)制的初步研究

余俊鍵　陳瑜　楊升平

摘要：目的 ?研究白果內(nèi)酯的心肌的保護(hù)作用。方法 ?于2018年3月～12月選取30只健康SD大鼠，隨機(jī)分為標(biāo)準(zhǔn)組、鹽水組、白果內(nèi)酯高、中、低劑量組，各6只。高、中、低劑量組大鼠分別以不同藥物劑量灌胃，鹽水組給生理鹽水2 ml，標(biāo)準(zhǔn)組不做任何處理，連續(xù)給藥1周后，取大鼠心肌組織，制作勻漿，測(cè)定各組心肌組織中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）的含量。結(jié)果 ?鹽水組與標(biāo)準(zhǔn)組SOD、MDA、CK、LDH含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;低劑量組SOD與標(biāo)準(zhǔn)組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，中、高劑量組SOD高于標(biāo)準(zhǔn)組;高、中、低劑量組MDA低于標(biāo)準(zhǔn)組，CK和LDH均高于標(biāo)準(zhǔn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 ?白果內(nèi)酯可以增強(qiáng)心肌組織抗氧化作用，避免細(xì)胞膜的破壞，抑制有害物質(zhì)釋放入血，最終達(dá)到心肌保護(hù)的目的。

關(guān)鍵詞：白果內(nèi)酯;心肌保護(hù);抗氧化作用

中圖分類號(hào)：R285.5 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.19.024

文章編號(hào)：1006-1959（2019）19-0083-03

Preliminary Study on the Anti-Oxidation Mechanism of Bilobalide in Rat Myocardium

YU Jun-jian1，CHEN Yu2，YANG Sheng-ping3

（1.Department of Cardiothoracic Surgery，the First Affiliated Hospital of Gannan Medical College， Ganzhou 341000，Jiangxi，China;

2.Department of Blood Transfusion，the First Affiliated Hospital of Gannan Medical College，Ganzhou 341000，Jiangxi，China;

3.Department of Internal Medicine，Sujbect One，Shangyou County Traditional Chinese Medicine Hospital，

Gansu 341200，Jiangxi，China）

Abstract：Objective ?To study the protective effect of bilobalide on myocardium. Methods ?30 healthy SD rats were randomly divided into standard group， saline group and bilobalide high， medium and low dose groups from March to December 2018，6 in each group. Rats in the high， middle and low dose groups were intragastrically administered with different drug doses. The saline group was given 2 ml of normal saline. The standard group did not do any treatment. After 1 week of continuous administration， the rat myocardial tissue was taken to prepare a homogenate. The content of superoxide dismutase （SOD）， malondialdehyde （MDA）， creatine kinase （CK）， and lactate dehydrogenase （LDH） in myocardial tissue.Results ?There was no significant difference in the content of SOD， MDA， CK and LDH between the saline group and the standard group （P>0.05）. There was no significant difference between the low dose group and the standard group. The SOD of the medium and high dose group was higher than that of the standard group. MDA in the middle and low dose groups was lower than the standard group， and CK and LDH were higher than the standard group， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion ?Bilobalide can enhance the anti-oxidation of myocardial tissue， avoid the destruction of cell membrane， inhibit the release of harmful substances into the blood， and finally achieve the purpose of myocardial protection.

Key words：Bilobalide;Myocardial protection;Antioxidant effect

白果內(nèi)酯（bilobalide）是一種倍半萜類化合物，來(lái)源于銀杏葉提取物。目前有文獻(xiàn)報(bào)道，白果內(nèi)酯對(duì)腦缺血中的神經(jīng)功能恢復(fù)具有顯著的保護(hù)作用[1]，在心臟缺血再灌注損傷中，可以降低對(duì)心肌細(xì)胞的氧自由基作用、減少心肌酶的釋放，降低凋亡的發(fā)生，從而達(dá)到心肌的保護(hù)作用[2]。同樣也有諸多相似的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了白果內(nèi)酯在心肌梗死中的保護(hù)機(jī)制。研究顯示，在人工處理的急性心肌梗死大鼠模型中，給予白果內(nèi)酯干預(yù)的大鼠心肌梗死的范圍和程度均可以明顯減少[3，4]，其具體的機(jī)制也在后期的實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)：白果內(nèi)酯具有擴(kuò)張血管，增加冠脈血流，增加氧供，減慢心率，降低心臟氧耗，改善心臟功能，保護(hù)心肌細(xì)胞的作用[5-7]。但目前關(guān)于白果內(nèi)酯藥理作用的研究不多，為研究其抗氧化作用，本研究旨在分析白果內(nèi)酯的藥理作用，為后期更進(jìn)一步的研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ?于2018年3月～12月選取健康SD大鼠30只，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物中心許可證號(hào)：SCXK（湘） 2016-0428，動(dòng)物合格證號(hào)：HNSLKJD：2016-0018，級(jí)別：清潔級(jí)，體重250～300 g，雌雄各半。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品與儀器 ?白果內(nèi)酯（天津市科曼思特醫(yī)藥科技發(fā)展公司，輝瑞制造，生產(chǎn)日期：20151018），相關(guān)試劑盒（山東邁威生化有限公司，生產(chǎn)日期：2016.11），MIKRO22R臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國(guó)HETTICH），超級(jí)恒溫水?。ㄉ綎|科威醫(yī)療器械有限公司）。

1.3建立大鼠模型 ?將30只健康SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為標(biāo)準(zhǔn)組、鹽水組、高劑量組、中劑量組、低劑量組五組，每組6只。模型建立：高、中、低劑量組大鼠分別以2.5、5、10 mg/kg白果內(nèi)酯灌胃，鹽水組大鼠2 ml生理鹽水灌胃，標(biāo)準(zhǔn)組不做其他處理，自然飼養(yǎng)。所有大鼠在7 d后處死，剪取心尖部組織，大約1～2 g，制作組織勻漿。

1.4觀察指標(biāo) ?按試劑盒使用說(shuō)明，測(cè)定心肌組織中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、肌酸激酶（CK）及乳酸脫氫酶（LDH）的含量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 ?實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料采用（x±s）表示，作單因素方差分析（F檢驗(yàn)）及組間k檢驗(yàn)，α=0.05，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1白果內(nèi)酯對(duì)大鼠心肌組織中SOD活性的影響 ?鹽水組與標(biāo)準(zhǔn)組SOD含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;低劑量組與鹽水組SOD含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;中劑量組及高劑量組與鹽水組SOD含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。同時(shí)高、中、低劑量組SOD含量逐漸下降，具有劑量依賴性。

2.2白果內(nèi)酯對(duì)大鼠心肌組織中MDA含量的影響 ?鹽水組MDA含量與標(biāo)準(zhǔn)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;高、中、低劑量組MDA含量均低于鹽水組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;同時(shí)高、中、低劑量組MDA含量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;MDA含量隨用藥劑量升高而降低，具有劑量依賴性，見表3。

2.3白果內(nèi)酯對(duì)大鼠心肌組織中CK活性的影響 ?鹽水組CK含量與標(biāo)準(zhǔn)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;高、中、低劑量組CK含量均高于鹽水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;高、中、低劑量組間CK含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表3。

2.4白果內(nèi)酯對(duì)大鼠心肌組織中LDH活性的影響 ?鹽水組LDH含量與標(biāo)準(zhǔn)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;高、中、低劑量組LDH含量與鹽水組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;但高、中、低劑量組間LDH含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表4。

3討論

心肌缺血后再灌注損傷是指心肌缺血恢復(fù)正常灌注但組織損傷呈現(xiàn)進(jìn)行性加重的病理過(guò)程[8]。心肌缺血后再灌注損傷的發(fā)生可能與細(xì)胞內(nèi)鈣離子過(guò)度蓄積、氧自由基增多、酸中毒及心肌纖維能量代謝障礙等機(jī)制有關(guān)[9]。缺血后再灌注首次是1960年Jennings ?等在犬科動(dòng)物身上發(fā)現(xiàn)的，研究發(fā)現(xiàn)缺血后再灌注的犬科動(dòng)物其心肌壞死程度加深[10]，而人體中“心肌缺血再灌注損傷”這個(gè)概念是在1985年被Braunwald等提出[11]。

心臟外科手術(shù)體外循環(huán)期間提高和加強(qiáng)心肌缺血再灌注損傷一直是一個(gè)難題，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者在理論和機(jī)制方面進(jìn)行了大量深入研究，提出了很多的方法和藥物，但效果仍未達(dá)到臨床要求，如何克服實(shí)驗(yàn)中的困難，突破臨床阻礙是當(dāng)前的一個(gè)難題。

心肌缺血后再灌注損傷的缺血心肌恢復(fù)正常，但組織損傷呈進(jìn)行性加重，心肌超微結(jié)構(gòu)、心功能和電生理等一系列損傷性變化表現(xiàn)得更為突出，患者可發(fā)生嚴(yán)重的心律失常而導(dǎo)致猝死[12，13]。臨床研究表明，檢測(cè)心肌損傷程度最有效最直觀的方法是檢測(cè)心肌酶，其中包括CK、CKMB、LDH等，因此選擇與臨床保持一致性的檢測(cè)指標(biāo)對(duì)本次研究具有巨大的優(yōu)勢(shì)。SOD是消除缺血再灌注損傷中氧自由基等有害物質(zhì)的主力軍;相反MDA是心肌損害的標(biāo)志物，是氧自由基作用脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)最終的產(chǎn)物，且具有細(xì)胞毒性，MDA的高低可反映心肌損害程度;CK廣泛地存在于骨骼肌、平滑肌。心肌組織中，因?yàn)槠涮厥庑?，存在于?xì)胞質(zhì)與線粒體中，對(duì)參與ATP的形成具有重要作用，其在心肌損傷的測(cè)定中敏感性最高， LDH具有5個(gè)亞型，出現(xiàn)心肌損傷時(shí)以LDH-1、LDH-2釋放入血，可以作為監(jiān)測(cè)心肌損傷的重要指標(biāo)，并且LDH在心肌損傷過(guò)程中持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)[14]。

臨床和實(shí)驗(yàn)條件下檢測(cè)指標(biāo)的區(qū)別在于血液中心肌酶的含量與心肌組織中心肌酶的含量成反比。心肌組織中的酶活性高，參與缺血再灌注損傷的程度也越高，被破壞入血的含量隨之減少;反之，血液中心肌酶含量高，說(shuō)明心肌細(xì)胞損害嚴(yán)重。本文通過(guò)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)組和鹽水組的大鼠作為對(duì)照，白果內(nèi)酯高、中、低劑量組分別以不同藥物劑量給大鼠進(jìn)行連續(xù)1周的灌胃，通過(guò)測(cè)定大鼠心肌組織中SOD、MDA、CK、LDH的含量來(lái)觀察白果內(nèi)酯對(duì)心肌組織抗氧化的作用，研究白果內(nèi)酯的心肌的保護(hù)作用。本研究中：鹽水組與標(biāo)準(zhǔn)組比較， SOD、MDA、CK、LDH含量均未見特殊變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與鹽水組相比，各個(gè)給藥組均可以不同程度提高大鼠心肌組織中SOD、CK、LDH的含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;各個(gè)給藥組之間比較，CK、LDH含量不隨劑量變化波動(dòng)，SOD、MDA表現(xiàn)出劑量依賴性。說(shuō)明白果內(nèi)酯可以增加心肌細(xì)胞內(nèi)去氧自由基作用，降低心肌細(xì)胞中MDA的含量，提高心肌組織中SOD活性，同時(shí)隨著藥物劑量的增加，MDA的含量隨之減低，SOD含量升高?？梢哉J(rèn)為白果內(nèi)酯可增強(qiáng)心肌組織中SOD、LDH、CK的活性，增強(qiáng)心肌缺血再灌注損傷時(shí)抗氧化作用，發(fā)揮去氧自由基自由，避免細(xì)胞膜的破壞，抑制心肌酶的釋放入血，最終減輕心肌損傷的程度。

綜上所述，白果內(nèi)酯廣泛參與在心肌保護(hù)各種的機(jī)制中，可減輕缺血缺氧帶來(lái)的心肌損傷，有效保護(hù)心肌組織，但更進(jìn)一步的機(jī)制尚需要研究完善，今后將進(jìn)一步觀察白果內(nèi)酯改善患者心功能，減少體外循環(huán)導(dǎo)致的心肌損害的作用，為臨床心血管病的治療提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]唐永鑫，李慧琴.白果內(nèi)酯對(duì)腦缺血損傷保護(hù)作用的研究進(jìn)展[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2018，41（7）：1203-1209.

[2]華駿.白果內(nèi)酯對(duì)缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制研究[D].南京醫(yī)科大學(xué)，2017.

[3]熊國(guó)營(yíng)，張凌云，李曉君.白果內(nèi)酯耐缺氧作用研究[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2015，21（36）：11-12.

[4]唐遠(yuǎn)鵬，曾靖，黃起壬.白果內(nèi)酯藥理作用的研究[J].贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，35（1）：153-155.

[5]劉秀萍，鄧方.銀杏內(nèi)酯和白果內(nèi)酯對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后VEGF的表達(dá)的影響[J].中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2015，32（2）：108-111.

[6]唐超園，祝麗欣，陳芝，等.血腦同步微透析研究大鼠口服銀杏酮酯后內(nèi)酯類成分的血腦分布[J].中草藥，2017，48（2）：272-277.

[7]胡翔，余俊健，胡容，等.白果內(nèi)酯對(duì)大鼠抗氧化作用的研究[J].江西中醫(yī)藥，2017，48（10）：71-72.

[8]張世平，沈鑫，李會(huì)玲，等.右美托咪定預(yù)處理對(duì)糖尿病大鼠心肌缺血-再灌注損傷的作用和機(jī)制[J].臨床麻醉學(xué)雜志，2018，34（7）：707-711.

[9]李俊平，郭麗麗，陳中，等.丹蔞片對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（1）：95-100.

[10]黃新宇，劉永林.白藜蘆醇激活Nrf2/ARE信號(hào)通路降低心肌缺血再灌注損傷大鼠炎癥和氧化應(yīng)激[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2017，35（6）：1516-1520.

[11]韋家俊，李浩， 廖小明，等.肢體缺血后處理對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠Caspase-3和細(xì)胞凋亡的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2017，37（4）：804-806.

[12]胡靜，谷小雨，孟炎，等.右美托咪定后處理對(duì)糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷及炎癥反應(yīng)的影響[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，37（11）：1506-1511.

[13]白樺，盧圣鋒，陳婉瑩，等.麥粒灸預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷不同時(shí)期保護(hù)效應(yīng)及Beclin1表達(dá)的影響[J].針刺研究，2017，42（6）：471-476.

[14]高維明，周原，任小宇.三七莖葉皂苷對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠急性心肌缺血的保護(hù)作用[J].現(xiàn)代藥物與臨床，2019，34（6）：1615-1619.