Caspase-3、survivin與胚胎停育的關(guān)系研究

何雙

摘要：目的 ?觀察胚胎停育婦女絨毛織組中caspase-3和survivin的表達(dá)，探討過(guò)度凋亡與胚胎停育的關(guān)系。方法 ?選取2018年5月1日～12月31日在天津市第一中心醫(yī)院婦科計(jì)劃生育門(mén)診確診胚胎停育患者30例作為觀察組，另選取同期在我院計(jì)劃生育門(mén)診正常妊娠要求人工流產(chǎn)的患者30例作為對(duì)照組，采用SP法檢測(cè)兩組患者絨毛組織中caspase-3和survivin的表達(dá)。結(jié)果 ?對(duì)照組光鏡下見(jiàn)絨毛組織大小一致，絨毛間可見(jiàn)正常結(jié)構(gòu)的間充質(zhì)細(xì)胞。觀察組光鏡下見(jiàn)絨毛組織發(fā)生不同程度的退行性改變，間充質(zhì)變性，結(jié)構(gòu)模糊，同時(shí)伴炎性反應(yīng);觀察組絨毛組織細(xì)胞及對(duì)照組絨毛組織細(xì)胞皆有caspase-3蛋白的表達(dá)，觀察組絨毛組織caspase-3表達(dá)量高于對(duì)照組，觀察組陽(yáng)性率為96.66%，高于對(duì)照組的86.66%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;觀察組絨毛組織細(xì)胞及對(duì)照組絨毛組織細(xì)胞皆有survivin蛋白的表達(dá)，觀察組絨毛組織survivin表達(dá)量低于對(duì)照組，觀察組陽(yáng)性率為73.33%，低于對(duì)照組的96.66%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 ?胚胎停育可能與絨毛組織中caspase-3高表達(dá)、survivin低表達(dá)導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡過(guò)度有關(guān)。

關(guān)鍵詞：胚胎停育;caspase-3;survivin;凋亡

中圖分類(lèi)號(hào)：R714.2 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.19.023

文章編號(hào)：1006-1959（2019）19-0080-03

Study on the Relationship Between Caspase-3，Survivin and Embryonic Stop

HE Shuang

（Department of Obstetrics and Gynecology，Tianjin First Central Hospital，Tianjin 300192，China）

Abstract：Objective ?To observe the expression of caspase-3 and survivin in embryos and women's chorionic villi， and to explore the relationship between excessive apoptosis and embryonic cessation.Methods ?From May 1st to December 31st， 2018， 30 cases of embryos were diagnosed in the gynecological family planning clinic of the First Central Hospital of Tianjin as the observation group， and the abortion was performed in the normal pregnancy of the family planning clinic in our hospital.30 patients were used as the control group. The expression of caspase-3 and survivin in the villus tissues of the two groups was detected by SP method.Results ?In the control group， the size of the villus was consistent under the light microscope， and the mesenchymal cells with normal structure were observed between the villi. Under the light microscope， the villus tissue showed different degree of degenerative changes， mesenchymal degeneration， structural ambiguity， and inflammatory reaction. The expression of caspase-3 protein was observed in the villous tissue cells of the observation group and the villus tissue cells of the control group. The expression of caspase-3 in the villus tissue of the observation group was higher than that of the control group. The positive rate of the observation group was 96.66%，the difference of 86.66% in the control group was statistically significant （P<0.05）. The expression of survivin protein was observed in the villous tissue cells of the observation group and the villous tissue cells of the control group. The expression of survivin in the villus tissue of the observation group was lower than that of the control group. The positive rate was 73.33%， which was lower than that of the control group 96.66%，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion ?Embryo arrest may be associated with excessive expression of caspase-3 in villus tissues and excessive apoptosis induced by low expression of survivin.

Key words：Embryonic stop;Caspase-3;Survivin;Apoptosis

隨著國(guó)家二胎政策的開(kāi)放，妊娠婦女人數(shù)增多，胚胎停育的發(fā)病率也逐步升高，調(diào)查顯示胚胎停育的患者高達(dá)13.4%[1]。胚胎停育，又稱(chēng)稽留流產(chǎn)，是指胚胎或胎兒已死亡滯留宮腔內(nèi)未能及時(shí)自然排出[2]。有研究顯示細(xì)胞過(guò)度凋亡參與了胚胎停育的發(fā)生[3]。Caspase-3是在胎盤(pán)絨毛組織表達(dá)的一種促凋亡蛋白，survivin是在胎盤(pán)絨毛組織表達(dá)的一種細(xì)胞凋亡抑制蛋白，本研究通過(guò)檢測(cè)胚胎停育患者絨毛組織中caspase-3、survivin的表達(dá)，分析細(xì)胞過(guò)度凋亡與稽留流產(chǎn)的關(guān)系，進(jìn)而指導(dǎo)臨床采取有效的預(yù)防措施，以期為優(yōu)生優(yōu)育指導(dǎo)提供理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料 ?選取2018年5月1日～12月31日在天津市第一中心醫(yī)院計(jì)劃生育門(mén)診確診胚胎停育需行清宮術(shù)的患者30例作為觀察組，另隨機(jī)選取同期在我院計(jì)劃生育門(mén)診正常妊娠要求人工流產(chǎn)的患者30例作為對(duì)照組。本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書(shū)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①月經(jīng)周期規(guī)律;②血HCG陽(yáng)性，經(jīng)我院B超確診宮內(nèi)孕，對(duì)照組患者B超顯示有胎心搏動(dòng)，觀察組患者B超顯示可見(jiàn)胎囊無(wú)胎心搏動(dòng)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近半年內(nèi)曾服用激素類(lèi)藥物;②曾放置宮內(nèi)節(jié)育器;③有藥物過(guò)敏史;④有生殖系統(tǒng)急性炎癥及腫瘤;⑤合并內(nèi)外科相關(guān)疾病。觀察組年齡20～40歲，平均年齡（26.83±5.52）歲;停經(jīng)40～63 d，平均停經(jīng)（44.00±3.20）d;胎囊最大徑線(xiàn)1.5～2.0 cm，平均徑線(xiàn)（1.90±0.45）cm。對(duì)照組年齡20～40歲，平均年齡（27.33±5.46）歲;停經(jīng)40～63 d，平均停經(jīng)（45.00±2.23）d，胎囊最大徑線(xiàn)1.4～2.0 cm，平均徑線(xiàn)（1.82±0.35）cm。兩組年齡、停經(jīng)時(shí)間及胎囊徑線(xiàn)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2方法 ?負(fù)壓吸宮術(shù)后取絨毛組織置于生理鹽水中沖洗2次，取小于0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm組織塊，置于4%多聚甲醛固定，取材，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，連續(xù)切片厚度為5 μm;將切片置于二甲苯及梯度乙醇中脫蠟，自來(lái)水及PBS沖洗后依次入甲醇雙氧水、蒸餾水及MPBS沖洗;將切片放入抗原修復(fù)液中經(jīng)加熱、冷卻及PBS沖洗進(jìn)行修復(fù)，切片上滴加正常山羊血清封閉液室溫20 min后滴加第一抗體（caspase-3及survivin抗體），4℃過(guò)夜，MBPS沖洗5 min×3次;滴加生物素化第二抗體（IgG），37℃，20 min，MBPS沖洗5 min×3次;切片上滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃，20 min，MBPS沖洗，5 min×3次;使用混勻DAB顯色試劑加至切片上顯色6 min，充分水洗;經(jīng)過(guò)蘇木素復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明后中性樹(shù)脂封片，在光鏡下觀察。

1.3判定標(biāo)準(zhǔn) ?光鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)淺棕黃色、棕黃色 、棕褐色顆粒為survivin、caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞。陽(yáng)性著色細(xì)胞分級(jí)：（A）判斷標(biāo)準(zhǔn)：<25%記0分，25%～50%記1分，50%～75%記2分，>75%記3分。陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度（B）判斷標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)著色或背景均勻一致，淡黃色記0分;淺棕黃色記1分;棕黃色記2分;棕褐色記3分。隨機(jī)選取5個(gè)不重疊的高倍視野（×400倍），根據(jù)兩項(xiàng)指標(biāo)的積分?jǐn)?shù)（積分=A×B）積分。積分0分：（-），1～3分：（+），4～6分：（++），7～9分：（+++）。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 ?所有數(shù)據(jù)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用（n，%）表示，比較采用？字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組病理形態(tài)比較 ?對(duì)照組患者光鏡下見(jiàn)絨毛組織大小一致，內(nèi)層細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞邊界清晰，外形為卵圓形或立方形，細(xì)胞漿透明，外層合體滋養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞核深染且有多個(gè)。絨毛間可見(jiàn)正常結(jié)構(gòu)的間充質(zhì)細(xì)胞，見(jiàn)圖1。觀察組患者光鏡下見(jiàn)絨毛組織發(fā)生不同程度的退行性改變，滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)量明顯減少并發(fā)生萎縮，間充質(zhì)變性，結(jié)構(gòu)模糊，同時(shí)伴炎性反應(yīng)，見(jiàn)圖2。

2.2兩組絨毛組織中caspase-3表達(dá)比較 ?觀察組絨毛組織細(xì)胞及對(duì)照組絨毛組織細(xì)胞皆有caspase-3蛋白的表達(dá)，觀察組絨毛組織caspase-3表達(dá)量高于對(duì)照組，觀察組陽(yáng)性率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（？字2=16.364，P=0.001），見(jiàn)表1。

2.3兩組絨毛組織中survivin表達(dá)比較 ?觀察組絨毛組織細(xì)胞及對(duì)照組絨毛組織細(xì)胞皆有survivin蛋白的表達(dá)，觀察組絨毛組織survivin表達(dá)量低于對(duì)照組，觀察組陽(yáng)性率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（？字2=8.419，P=0.038），見(jiàn)表2。

3討論

胚胎停育近年來(lái)一直是婦產(chǎn)科優(yōu)生與遺傳領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其發(fā)病原因錯(cuò)綜復(fù)雜，具體發(fā)病機(jī)制尚未明確[4]。目前認(rèn)為與染色體異常、內(nèi)分泌異常、感染、抗生殖免疫抗體、年齡、環(huán)境等因素相關(guān)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的研究證實(shí)胚胎停育促凋亡基因及抑制凋亡基因表達(dá)異常相關(guān)[5，6]。受精卵著床后，經(jīng)過(guò)定位、黏附和侵入三個(gè)過(guò)程，滋養(yǎng)細(xì)胞穿透侵入子宮內(nèi)膜，輔助胚胎著床。正常情況下，滋養(yǎng)細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞抗凋亡與細(xì)胞凋亡之間的平衡實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖，在妊娠早期，應(yīng)以絨毛和蛻膜組織細(xì)胞增殖為主[7]，妊娠晚期應(yīng)以細(xì)胞凋亡為主，絨毛組織細(xì)胞增殖/凋亡的平衡狀態(tài)有利于絨毛內(nèi)血管及分支形成和相關(guān)的侵襲能力的保持[8]。細(xì)胞凋亡是主動(dòng)、有序由基因調(diào)控的自我凋亡過(guò)程，通過(guò)清除壞死細(xì)胞，分解ATP，進(jìn)入能量循環(huán)[9]。本研究從促凋亡因子caspase-3與抑制凋亡因子survivin入手，證實(shí)二者介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)度參與了胚胎停育的發(fā)生。

促凋亡蛋白caspase-3是caspase家族中的一員，caspase家族是一組在細(xì)胞凋亡機(jī)制中占據(jù)重要地位的蛋白酶，又稱(chēng)“天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶”，特異性作用于底物的天冬氨酸殘基，caspase-3及其前體pro-caspase-3是目前發(fā)現(xiàn)的在胚胎胎盤(pán)組織中唯一表達(dá)的caspase成員，與CED-3同源性最高，處于caspase家族介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡傳導(dǎo)通路的下游，其表達(dá)增高會(huì)啟動(dòng)線(xiàn)粒體/細(xì)胞色素C及Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路。Caspase-3一旦被激活，凋亡將不可逆轉(zhuǎn)，凋亡通路一旦活化將促使胚胎絨毛細(xì)胞大量凋亡[10]，絨毛細(xì)胞過(guò)度凋亡勢(shì)必阻礙絨毛組織生長(zhǎng)，導(dǎo)致胚胎停止發(fā)育?？梢哉J(rèn)為絨毛組織中caspase-3表達(dá)增加，提示絨毛組織中存在細(xì)胞過(guò)度凋亡。本研究中，觀察組絨毛組織及對(duì)照組正常早孕絨毛組織中皆有caspase-3的表達(dá)，表明促凋亡蛋白caspase-3參與了正常生理狀態(tài)下絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞增殖/凋亡的平衡，而觀察組絨毛組織中caspase-3的表達(dá)量高于對(duì)照組（P<0.05），證明胚胎停育患者絨毛組織中caspase-3基因高表達(dá)，細(xì)胞凋亡信號(hào)過(guò)強(qiáng)， caspase-3蛋白產(chǎn)生過(guò)量，細(xì)胞凋亡過(guò)度，打破了絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞增殖/凋亡的平衡，導(dǎo)致胚胎停止發(fā)育。

抑制凋亡因子survivin是細(xì)胞凋亡抑制蛋白（inhibiting apoptosis protein，IAP）中最小的成員，是迄今為止發(fā)現(xiàn)作用最強(qiáng)的凋亡抑制因子，是由Ambrosini等應(yīng)用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體-1的cDNA通過(guò)雜交的方法在人類(lèi)基因組文庫(kù)中篩選出來(lái)。Survivin主要在胚胎組織及腫瘤組織中表達(dá)，在分化成熟的正常組織中表達(dá)水平較低[11]。Survivin在調(diào)控細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其通過(guò)抑制線(xiàn)粒體/細(xì)胞色素C介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路，阻斷下游的caspase活化以及抑制p53的功能等多種途徑發(fā)揮抗凋亡作用[12]。此外，survivin還可以上調(diào)同家族其它成員的作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，間接調(diào)控妊娠早期高度增生的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡。有研究顯示[13]，米非司酮可以下調(diào)survivin蛋白的表達(dá)，以誘導(dǎo)早孕絨毛、蛻膜組織細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗早孕的目的。王莉等[14]研究顯示，早產(chǎn)胎盤(pán)組織中survivin的表達(dá)明顯低于足月分娩組，證實(shí)survivin低表達(dá)引起的細(xì)胞過(guò)度凋亡導(dǎo)致了不良妊娠結(jié)局。本研究應(yīng)用免疫組化法，檢測(cè)到觀察組絨毛及對(duì)照組絨毛組織中皆有survivin蛋白的表達(dá)，而觀察組絨毛組織中survivin蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組（P<0.05），證明survivin的低表達(dá)使抗凋亡作用減弱，caspase-3過(guò)量表達(dá)間接誘發(fā)細(xì)胞過(guò)度凋亡，阻礙絨毛增殖，胚胎停止發(fā)育。

綜上所述，絨毛組織中caspase-3、survivin蛋白的異常表達(dá)與胚胎停育發(fā)生密切相關(guān)。本研究目前僅從組織學(xué)方面研究caspase-3、survivin與胚胎停育發(fā)生的關(guān)系，尚未在臨床診治中進(jìn)行探討，因樣本數(shù)量有限，且引起胚胎停育的原因眾多，caspase-3、survivin引起細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)機(jī)制需要更多的細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)性研究支持，從而指導(dǎo)臨床診治及預(yù)防胚胎停育。

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