小茴香精油成分測定及性能研究

姜楠楠，陳小亮，董娜，王建清

(1.河南工學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000；2.天津科技大學(xué)，天津 300222)

小茴香(FoenicuzuvulgareMill.)為傘形科植物茴香的干燥成熟果實，不僅是一種調(diào)味品，而且是傳統(tǒng)中藥。鐘瑞敏等針對小茴香籽精油對7種食源性致病菌和2種腐敗性真菌進行抗菌活性研究，小茴香籽精油表現(xiàn)出優(yōu)良的廣譜性抗菌活性，其中黑曲霉和副溶血性嗜鹽菌對該精油的最小抑菌量(MIC)分別小于0.004%和0.015%(體積分?jǐn)?shù))[1]。陳佳麗等從燒雞中分離、鑒定出腐敗菌為產(chǎn)黃青霉菌，將小茴香等香辛料對其腐敗菌進行抑菌效果研究，最小抑菌濃度為0.8 g/mL[2]。

本文采用水蒸氣蒸餾法從小茴香果實中提取精油。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)分析小茴香精油的化合物成分，對其進行定性與定量。通過傅里葉紅外光譜對小茴香精油主要成分在光照時長與pH值條件下的穩(wěn)定性進行分析。并對小茴香及其主要成分對青霉的抑菌效果進行測試，顯示效果良好。通過對小茴香及其主要成分測定及性能分析，為小茴香的進一步開發(fā)利用研究提供了實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗所用材料

小茴香(食品級)：甘肅省安國市祁澳中藥飲片有限公司；95%乙醇(分析純)、蒸餾水、草酸(分析純)：天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉(分析純)、蔗糖(分析純)：天津市江天化工技術(shù)有限公司；瓊脂(生物試劑)：天津市珠江衛(wèi)生材料廠；反式茴香腦標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)：Sigma-Aldrich公司；4-烯丙基苯甲醚標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純)：ACROS公司；青霉(生化試劑)：天津科技大學(xué)食品與生物技術(shù)學(xué)院。

1.2 實驗所用儀器與設(shè)備

HY34型電子天平 奧豪斯儀器有限公司；AR2130型千分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；FW177型中草藥粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；DGG型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津天宇機電有限公司；Varian 4000MS型GC-MS色譜儀 美國瓦里安公司；Eppendorf型移液槍 北京東南儀誠試驗室設(shè)備有限公司；DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Check Mate 9900型氣體分析儀 丹麥拔萃公司；VECTOR 22型傅立葉變換紅外光譜儀 德國布魯克儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 小茴香精油提取

圖1 常壓水中蒸餾裝置

1.3.2 小茴香精油成分分析

1.3.2.1 小茴香精油GC-MS分析

色譜條件：柱子型號：VF-5MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm；進樣口溫度：300 ℃；分流比：100；載氣：He，99.999%；流速：1 mL/min；程序升溫：初始溫度100 ℃，然后以10 ℃/min升至300 ℃，保持10 min。質(zhì)譜條件：離子源：EI；離子阱溫度：220 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；掃描方式：全掃描；掃描范圍：50～500 m/z。利用NIST05 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫-計算機聯(lián)機檢索。

1.3.2.2 小茴香精油主要成分定性/定量分析

定性分析：取1 mL樣品稀釋1000倍取1 μL進樣，利用NBS75K標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫-計算機聯(lián)機檢索，與質(zhì)譜圖集的標(biāo)準(zhǔn)譜圖進行對照，結(jié)合有關(guān)文獻進行人工譜圖解析，確認(rèn)樣品中的各個化學(xué)成分及其相對含量。

定量分析：取樣品、主要成分的標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋1000倍，再分別稀釋到100，50，20，10，5 mg/L，然后各取1 μL進樣，在同等的條件下進行GC-MS分析。運用氣相色譜外標(biāo)法建立樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出主要成分的絕對含量。

1.3.3 小茴香精油主要成分穩(wěn)定性分析

采用傅里葉變換紅外光譜儀對反式茴香腦和4-烯丙基苯甲醚標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性進行分析。具體方法：采用壓片法，取干燥的KBr粉末0.15 mg，在瑪瑙研缽中研細(xì)混合均勻后，加入壓模內(nèi)，制成一定直徑及厚度的透明片。在此薄片上滴少許標(biāo)品經(jīng)自然光照射0，1，2，3，4，5 h后，將此薄片放入儀器光束中進行測定，掃描范圍為500～4000 cm-1。以官能團變化評價光照對穩(wěn)定性的影響。將4-烯丙基苯甲醚和反式茴香腦通過NaOH醇溶液和HCl醇溶液稀釋至pH 2和pH 10的酸堿溶液，靜置1 h用KRS5液體紅外檢測池測定其紅外吸收波峰，以官能團的變化評價pH值對穩(wěn)定性的影響。

1.3.4 小茴香精油抑菌效果實驗

1.3.4.1 試樣準(zhǔn)備

供試菌株的制備：選取的供試菌株為青霉，分離自發(fā)病櫻桃果實。將供試菌種轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)48 h。取2支供實驗用，其余冷藏備用。

培養(yǎng)基的制備：具體配方：馬鈴薯200 g，蔗糖(或葡萄糖)20 g，瓊脂14～20 g，水1000 mL，pH自然。制作要點：馬鈴薯去皮，切成塊煮沸30 min，然后用紗布過濾，再加糖及瓊脂，溶化后補足水至 1000 mL。分裝，高壓濕熱滅菌(121 ℃，20 min)備用。

菌懸液的制備：挑取菌落接種平皿，霉菌培養(yǎng)48 h，用無菌生理鹽水洗脫，玻璃珠打散，制成菌懸液，調(diào)菌懸液濃度為107CFU/mL備用。

1.3.4.2 抑菌活性研究(濾紙片擴散法)

將直徑為6 mm的圓形空白濾紙片經(jīng)160 ℃干熱滅菌2 h后，無菌條件保存?zhèn)溆?。用無菌移液器吸取活化并調(diào)整好菌液濃度的各菌懸液0.3 mL加入到已倒好培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，干熱滅菌玻璃涂布器將菌懸液涂布均勻。將無菌濾紙片放入培養(yǎng)皿中央，用無菌移液槍吸取10 μL植物提取物到濾紙片上，每種菌平行做2個皿，然后用相應(yīng)的提取溶劑作陰性對照。細(xì)菌在生化培養(yǎng)箱中37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，霉菌在生化培養(yǎng)箱中28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，采用十字交叉法量取抑菌圈直徑，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 小茴香精油成分分析

2.1.1 小茴香精油GC-MS 分析

按1.3.2中氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)條件對水蒸氣蒸餾提取制得的小茴香精油進行成分分析，其GC色譜圖總離子流圖見圖2。利用NIST05 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫-計算機聯(lián)機檢索系統(tǒng)，與質(zhì)譜圖集的標(biāo)準(zhǔn)譜圖進行對照、復(fù)合，結(jié)合有關(guān)文獻確定小茴香精油主要化學(xué)成分，再結(jié)合毛細(xì)管氣相色譜面積歸一化法對各組分的相對含量進行計算，分析鑒定結(jié)果見表1。

圖2 小茴香水蒸氣蒸餾提取物的總離子流圖

峰號化合物名稱保留時間(min)百分含量(%)1異丙基甲苯3.4380.1762雙戊烯3.4961.2993桉葉油3.5620.12644-異丙基-1-甲基-1,4-環(huán)己二烯3.8100.7225松油烯4.1830.02661,3,3-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-酮4.3171.17472,6-二甲基-2,4,6-辛三烯4.7100.0278左旋樟腦5.2970.04394-萜品醇5.8110.064104-烯丙基苯甲醚6.093.996112,4,6-三甲基苯甲醛7.2370.20912對甲氧基苯甲醛7.3970.04313反式茴香腦8.02592.03

2.1.2 小茴香精油主要成分的定性、定量分析

2.1.2.1 小茴香精油主要成分定性分析

GC-MS相同條件進樣，保留時間一致可判定為同種物質(zhì)。4-烯丙基苯甲醚、反式茴香腦標(biāo)準(zhǔn)品和小茴香精油的總離子流圖譜的對比。由圖3可知，4-烯丙基苯甲醚和反式茴香腦是小茴香提取物的主要化學(xué)成分，總離子流圖譜出峰時間與化合物的種類相對應(yīng)，所以判定小茴香提取物總離子流圖譜中第一個主要峰代表4-烯丙基苯甲醚，第二個主要峰代表反式茴香腦，此結(jié)果進一步驗證了NIST05 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫分析結(jié)果，與鐘瑞敏、郭婷婷等[3]關(guān)于小茴香主要成分的報道相一致?？傠x子流圖譜上的峰面積代表該化學(xué)成分的相對含量，由圖3可知，小茴香提取物中反式茴香腦的含量高于4-烯丙基苯甲醚。

圖3 反式茴香腦、4-烯丙基苯甲醚標(biāo)品與小茴香提取物的總離子流對比圖

2.1.2.2 小茴香精油主要成分定量分析

反式茴香腦和4-烯丙基苯甲醚標(biāo)品根據(jù)GC-MS條件依次稀釋至5,10,20,50,100 mg/L等一系列濃度后，氣相色譜質(zhì)譜分析得5個濃度總離子流圖譜[4]，見圖4和圖5。

圖4 不同濃度下4-烯丙基苯甲醚標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖譜

圖5 不同濃度下反式茴香標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖譜

分別記錄4-烯丙基苯甲醚和反式茴香腦在不同濃度相對出峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，相對峰面積為縱坐標(biāo)分別做4-烯丙基苯甲醚和反式茴香腦的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖6和圖7。

根據(jù)圖4的圖譜分析結(jié)果，以濃度為橫坐標(biāo)，相對峰面積對縱坐標(biāo)，運用氣相色譜外標(biāo)法建立樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖6。由標(biāo)準(zhǔn)曲線得4-烯丙基苯甲醚線性回歸方程為y=1863x+4544.7。將稀釋10000倍的小茴香精油在同樣條件下進樣，利用毛細(xì)管氣相色譜面積歸一化法計算小茴香揮發(fā)油中4-烯丙基苯甲醚和反式茴香腦相對含量，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程多次進樣取平均值，結(jié)果表明小茴香精油中4-烯丙基苯甲醚絕對含量為32.23 mg/mL。

圖6 4-烯丙基苯甲醚濃度標(biāo)準(zhǔn)品曲線

根據(jù)圖5的圖譜分析結(jié)果，以濃度為橫坐標(biāo)，相對峰面積對縱坐標(biāo)，運用氣相色譜外標(biāo)法建立樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖7。由標(biāo)準(zhǔn)曲線得反式茴香腦的回歸方程y=2301x-9205。將稀釋10000倍的小茴香精油在同樣條件下進樣，利用毛細(xì)管氣相色譜面積歸一化法計算反式茴香腦相對含量，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程多次進樣取平均值，結(jié)果表明小茴香精油中反式茴香腦絕對含量為96.7 mg/mL。

圖7 反式茴香腦線性回歸圖

2.2 小茴香精油主要成分穩(wěn)定性研究

2.2.1 反式茴香腦穩(wěn)定性分析

圖8 傅里葉紅外光譜法反式茴香腦對不同 pH值的穩(wěn)定性分析

由圖8可知，處理后的紅外譜圖相對于空白樣，無能量的偏移和價鍵的生成，說明反式茴香腦比較穩(wěn)定，pH值沒有引起其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

圖9 傅里葉紅外光譜法反式茴香腦對光照的穩(wěn)定性分析

經(jīng)不同光照時間照射組與未經(jīng)過光照照射組對比，紅外光譜圖變化不大，只有在3417 nm處光照1 h樣品吸收峰較大，這可能是由于此樣品量相對于其他組較多，從而使此處價鍵的吸收峰值變大，屬于誤差影響導(dǎo)致[6]。綜上所述，反式茴香腦對光照時長變化、pH值變化條件均比較穩(wěn)定，這些因素的改變沒有引起其結(jié)構(gòu)性質(zhì)發(fā)生改變。

2.2.2 4-烯丙基苯甲醚穩(wěn)定性分析

選取不同pH值和光照時間為研究對象，通過傅里葉紅外光譜對4-烯丙基苯甲醚進行分析，見圖10和圖11。

圖10 傅里葉紅外光譜法4-烯丙基苯甲醚對pH值穩(wěn)定性分析

圖11 傅里葉紅外光譜法4-烯丙基苯甲醚對光照的穩(wěn)定性分析

用NaOH醇溶液和HCl醇溶液將4-烯丙基苯甲醚和小茴香精油稀釋到相同濃度10-3后，測定其在pH 2和pH 10條件下的紅外光譜圖[7]。由圖10可知，酸堿處理后分子價鍵無偏移和伸縮震動，說明沒有新的價鍵生成和減少。只是在3423 nm處，相對于空白樣，酸堿處理后峰的強度增大，這可能是氫鍵結(jié)合醇和羧酸能力增強所導(dǎo)致的[8]。由圖11可知，不同光照時間處理后，處理組相對于對照組幾乎沒有變化，說明4-烯丙基苯甲醚對光不敏感，光照對穩(wěn)定性影響不大。

2.3 小茴香精油主要抑菌成分篩選

小茴香、反式茴香腦、4-烯丙基苯甲醚對青霉抑菌6 d后效果圖見圖12[9]。

圖12 小茴香精油及其主要成分對青霉抑菌效果圖

由圖12可知，6 d后小茴香對青霉抑菌圈直徑為9 cm 。對比反式茴香腦和4-烯丙基苯甲醚的抑菌效果發(fā)現(xiàn)，同樣時間下4-烯丙基苯甲醚抑菌圈直徑較小，為4 cm，而反式茴香腦培養(yǎng)皿剛剛有菌絲生長，說明反式茴香腦的抑菌效果較好，并優(yōu)于4-烯丙基苯甲醚[10]，證明小茴香中起到抑菌作用的主要成分為反式茴香腦。

3 結(jié)論

采用水蒸氣蒸餾法從小茴香中提取精油。通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)對小茴香水蒸氣蒸餾提取精油進行定性分析，結(jié)果表明：小茴香精油主要成分為反式茴香腦和4-烯丙基苯甲醚。用毛細(xì)管氣相色譜面積歸一化法計算小茴香揮發(fā)油中4-烯丙基苯甲醚和反式茴香腦相對含量，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程多次進樣取平均值得反式茴香腦和4-烯丙基苯甲醚絕對含量分別為96.7 mg/mL和32.23 mg/mL。

采用傅里葉紅外光譜(FRIT)技術(shù)對小茴香精油兩種主要成分在光照、pH 2與pH 10的條件下測試穩(wěn)定性，結(jié)果表明：酸堿條件與光照時間變化條件沒有引起反式茴香腦和4-烯丙基苯甲醚新官能團生成和能量的偏移，說明酸堿條件與光照條件對其穩(wěn)定性的影響極小。

研究小茴香及其兩種主要成分對青霉的抑菌效果，結(jié)果表明反式茴香腦抑菌效果最好，優(yōu)于4-烯丙基苯甲醚。