正交試驗優(yōu)化苦蕎黃酮提取工藝

米智，劉荔貞，武曉紅，梁艷茹

(1.山西大同大學 生命科學學院，山西 大同 037009；2.山西大同大學 化學與環(huán)境工程學院，山西 大同 037009)

蕎麥屬于雙子葉蓼科類植物[1]，分為普通蕎麥和苦蕎麥兩種。苦蕎即苦蕎麥，學名韃靼蕎麥，別名蕎葉七、野蘭蕎、萬年蕎、菠麥、烏麥、花蕎等，起源于我國西南部，栽培于我國東北、內(nèi)蒙古、河北、山西、陜西、甘肅、青海、四川、云南等地。亞洲、歐洲和北美也有栽培[2,3]。苦蕎中含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，包括碳水化合物、葡萄糖、蛋白質(zhì)、多酚類、植物固醇、維生素、油酸、亞油酸、類胡蘿卜素、微量元素和礦物質(zhì)等。苦蕎麥中富含人體必需的8種氨基酸，是糧食中氨基酸含量之首。此外，苦蕎中的維生素、礦物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)也遠高于其他作物，由于其富含黃酮類化合物，具有多種生理功能，被譽為“藥食同源作物”[4]，也有“五谷之王”的美稱[5]?！侗静菥V目》記載：“苦蕎味苦，性平寒，能實腸胃，益氣力，續(xù)精神，利耳目，煉五臟渣穢”[6]。

與普通蕎麥相比，苦蕎含有更多的蘆丁、槲皮素、山奈酸、蕓香糖苷等黃酮類物質(zhì)[7]，這些具有生物活性成分的苦蕎黃酮對人體有抗氧化、清除氧自由基、降血糖、降血脂、改善認知功能、抗高血壓和抗動脈粥樣硬化等作用，被譽為“三降食品”(降血糖、降血脂和降血壓)[8]。同時還具有抑菌、抗病毒、防癌、預防多種慢性疾病等功效，在食品加工中廣泛用于各種糕點、調(diào)味食品、保健食品等的生產(chǎn)，深受人們的喜愛[9-11]。產(chǎn)于山西的苦蕎麥中總黃酮含量顯著高于湖南、寧夏、貴州、云南等地的苦蕎麥[12]。

目前，關(guān)于苦蕎黃酮不同部位化合物分離、提純的研究較多，主要有對苦蕎麩皮黃酮的乙醇浸提法和微波提取法[13，14]；也有大孔樹脂分離法和酶提取法[15，16]；但對苦蕎食用部位麥粒黃酮的提取方法主要有傳統(tǒng)的水煎煮法和超臨界流體萃取法[17]。本文采取的索氏提取法具有選擇性好、能耗低、設備操作簡便等優(yōu)點，適于實驗室應用；黃酮易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑，但甲醇和丙酮均具有一定的毒性，乙醇無毒且沸點低，適于索氏提取法進行苦蕎麥粒中黃酮的提取，且使用乙醇為提取劑時回收利用方便，乙醇回流法提取的黃酮要比水煎煮高得多，有利于降低生產(chǎn)成本[18]。以苦蕎麥粒為研究對象，利用正交試驗探究索氏提取法提取苦蕎麥粒中黃酮的最佳工藝條件，為苦蕎麥粒中黃酮的開發(fā)利用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山西廣靈苦蕎：山西省農(nóng)業(yè)科學院高寒作物研究所提供；蘆丁標準品：南京奧多福尼生物科技有限公司；無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等。

1.2 儀器與設備

恒溫水浴鍋、酸度計、精密電子天平、真空抽濾裝置、數(shù)顯恒溫水浴鍋、紫外/可見分光光度計、高速中藥粉粹機、索氏提取器等。

1.3 方法

1.3.1 蘆丁標準曲線的建立

準確稱取蘆丁標準品10 mg，加少量乙醇，在超聲波輔助下，搖勻使之充分溶解并定容至50 mL，得0.2 mg/mL蘆丁標準液[19]。

取6個干燥潔凈的25 mL容量瓶，按表1的順序加入試劑。

表1 蘆丁標準曲線的制作

以0號容量瓶為空白對照，在510 nm處用紫外/可見分光光度計測定吸光值，測定3次求平均值，做回歸處理。

1.3.2 苦蕎處理及黃酮提取工藝流程

選擇無發(fā)霉、無機械傷、無病蟲害、顆粒飽滿的苦蕎種子，放入電熱恒溫鼓風干燥箱中，在50 ℃下干燥2 h后，用萬能粉碎機粉碎成苦蕎粉末，并使苦蕎粉通過60目篩，收集苦蕎粉末于干燥的容器中待用。

黃酮提取工藝流程：苦蕎→清選→烘干→粉碎→過篩→稱重→分裝小包→乙醇回流浸提→提取液定容→測定吸光值→計算提取率。

1.3.3 苦蕎總黃酮的測定方法

精確量取1 mL提取液作為待測液，方法同1.3.1，在510 nm處測吸光值，做3組平行試驗求平均值，代入線性回歸方程，得到苦蕎總黃酮的含量。

式中：C為苦蕎總黃酮濃度，mg/mL；N為稀釋的倍數(shù)；V為提取液總體積，mL；W為樣品的質(zhì)量，g；1000為mg和g之間的轉(zhuǎn)化率。

1.3.4 苦蕎總黃酮提取工藝的單因素試驗[20]

1.3.4.1 乙醇濃度

準確稱取苦蕎粉末2 g，在加醇量為苦蕎質(zhì)量的7倍、回流時間為2 h、提取次數(shù)為2次的前提下，設置乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%提取苦蕎中的總黃酮，并在510 nm處測定提取液的吸光值，計算黃酮提取率。

1.3.4.2 乙醇添加倍數(shù)

準確稱取苦蕎粉末2 g，在乙醇濃度為70%、回流時間為2 h、提取次數(shù)為2次的前提下，設置乙醇添加量為苦蕎質(zhì)量的6，7，8，9，10倍提取苦蕎中的總黃酮，并在510 nm處測定提取液的吸光值，計算黃酮提取率。

1.3.4.3 提取次數(shù)

準確稱取苦蕎粉末2 g，在乙醇濃度為70%、回流時間為2 h、加醇量為苦蕎質(zhì)量7倍的前提下，設置提取次數(shù)為1，2，3，4，5次提取苦蕎中的總黃酮，并在510 nm處測定提取液的吸光值，計算黃酮提取率。

1.3.4.4 回流時間

準確稱取苦蕎粉末2 g，在乙醇濃度為70%、加醇量為苦蕎質(zhì)量的7倍、提取次數(shù)為2次的前提下，設置回流時間為1，1.5，2，2.5，3 h提取苦蕎中的總黃酮，并在510 nm處測定提取液的吸光值，計算黃酮提取率。

1.3.5 苦蕎總黃酮提取工藝的正交試驗

準確稱取苦蕎粉末2 g，參考1.3.4單因素試驗結(jié)果，在乙醇濃度、加醇量、提取次數(shù)和回流時間4個單因素中，分別選出3個對苦蕎總黃酮提取率影響最大的水平，做L9(34)正交試驗。

1.3.6 苦蕎總黃酮提取工藝的驗證性試驗

為了更好地證實乙醇回流法提取苦蕎總黃酮的可靠性和合理性，在正交試驗的基礎上，進行了3次平行試驗，分別計算出該條件下的最佳提取率。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

以蘆丁濃度(C，m/V)為橫坐標，吸光值OD510為縱坐標，制作標準曲線，得出線性回歸方程：y=9.167x+0.171，R2=0.991。

2.2 苦蕎總黃酮提取工藝的單因素試驗結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對苦蕎黃酮提取率的影響

圖1 不同乙醇濃度對苦蕎黃酮提取率的影響

由圖1可知，當乙醇濃度低于70%時，苦蕎黃酮提取率隨乙醇濃度增大而提高，在乙醇濃度為70%時黃酮提取率達到最大，約為2.84%；當乙醇濃度超過70%后，隨著乙醇濃度的提高，黃酮提取率反而降低。因此在做正交試驗時，選取乙醇濃度分別為60%、70%、80%作為3個水平。

2.2.2 乙醇添加倍數(shù)對苦蕎黃酮提取率的影響

圖2 乙醇添加倍數(shù)對苦蕎黃酮提取率的影響

由圖2可知，苦蕎黃酮提取率隨著乙醇添加量的增大而提高，當乙醇添加量是苦蕎質(zhì)量的7倍時，苦蕎黃酮提取率達到最大值，約為2.86%；當乙醇添加量超過苦蕎質(zhì)量的7倍時，隨著乙醇添加量的增加，黃酮提取率反而降低。因此在做正交試驗時，選取乙醇添加量分別為苦蕎質(zhì)量的6，7，8倍作為3個水平。

2.2.3 提取次數(shù)對苦蕎黃酮提取率的影響

由圖3可知，苦蕎黃酮提取率隨著提取次數(shù)的增加而提高，當提取3次時，黃酮提取率達到最高值，約為3.17%，隨著抽提次數(shù)的增加，苦蕎黃酮的提取率反而降低。因此在做正交試驗時，選取抽提次數(shù)分別為2，3，4次作為3個水平。

圖3 提取次數(shù)對苦蕎黃酮提取率的影響

2.2.4 回流時間對苦蕎黃酮提取率的影響

圖4 回流時間對苦蕎黃酮提取率的影響

由圖4可知，當回流時間不足2 h時，苦蕎黃酮提取率隨著回流時間的延長而提高，且回流2 h時黃酮提取率達到最大值，約為2.95%，隨著回流時間的延長，苦蕎黃酮提取率反而有所降低。因此在做正交試驗時，選取回流時間分別為1.5，2，2.5 h作為3個水平。

2.3 苦蕎總黃酮提取工藝的正交試驗結(jié)果

正交試驗設計見表2。

表2 L9(34)正交試驗因素水平表

表3 苦蕎黃酮提取正交試驗結(jié)果與分析

續(xù) 表

由表3可知，最佳的提取工藝條件為A2B2C3D1，由極差值R的大小可知各因素對本試驗方法的影響次序為：C(乙醇濃度)>B(提取次數(shù))>D(回流時間)>A(加醇量)。

由表4可知，在索氏提取法提取苦蕎黃酮工藝中，選取的4個因素乙醇濃度、加醇量、回流時間和提取次數(shù)對苦蕎黃酮提取率的影響均不顯著。

2.4 優(yōu)化條件的驗證性試驗

根據(jù)正交試驗結(jié)果分析，篩選出苦蕎總黃酮提取的最佳工藝，然后進行3組重復試驗，對正交試驗結(jié)果的可靠性和準確性進行驗證。測得苦蕎黃酮得率，見表5。

由表5可知，3組平行樣數(shù)據(jù)的RSD為0.28%，滿足要求，得出該提取工藝條件下苦蕎黃酮提取率較為穩(wěn)定。

3 結(jié)論

由正交試驗結(jié)果及方差分析可知，索氏提取法提取苦蕎黃酮的最佳工藝為：乙醇添加量為苦蕎質(zhì)量的7倍，提取3次，乙醇濃度為80%和回流時間為1.5 h。影響程度為：乙醇濃度>提取次數(shù)>回流時間>加醇量，4個因素對苦蕎黃酮提取率的影響均不顯著。由驗證性試驗可知，該工藝黃酮提取率最高，相對標準偏差(0.28%)較小，試驗穩(wěn)定可靠。為今后研究苦蕎中黃酮等成分的提取提供了試驗依據(jù)。