高產(chǎn)2-苯乙醇酵母的篩選及其發(fā)酵條件優(yōu)化

郭孝敬，鄭曉吉，史學(xué)偉，王斌，陳歡，黃倩，徐振麗

(石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000)

苯乙醇(2-phenylethanol)是一種具有淡雅、細(xì)膩柔和玫瑰香型的高級芳香醇，對氧和堿的作用都比較穩(wěn)定。天然存在于植物的葉、莖及玫瑰精油中，是多種香料風(fēng)味的基礎(chǔ)組分，具有協(xié)同增效的作用，其衍生物乙酸苯乙酯也是玫瑰香型主要成分[1]，被廣泛應(yīng)用于乳制品和調(diào)味品的生產(chǎn)等領(lǐng)域，如是奶酪、谷氨酸發(fā)酵、醋和醬油發(fā)酵中悅?cè)说闹匾L(fēng)味組分[2-4]，也是被國內(nèi)外所認(rèn)可的食品添加劑[5,6]。而以其為底物合成的苯乙醇苷具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌和強心等作用[7]。2-苯乙醇無論作為調(diào)味品還是在醫(yī)藥領(lǐng)域都具有重要的研究價值。

目前市場上2-苯乙醇主要以苯、甲苯和苯乙烯為原料通過化學(xué)法合成，合成過程中產(chǎn)生的一些副產(chǎn)物具有致癌作用且難以去除，食用級別高純度2-苯乙醇難以獲得[8,9]。而天然和化學(xué)合成2-苯乙醇價格上的差距促使人們探尋天然合成2-苯乙醇的途徑[10]。從植物中萃取2-苯乙醇工序繁瑣、價格昂貴且受季節(jié)限制。根據(jù)相關(guān)法律規(guī)定，微生物以天然的前體轉(zhuǎn)化合成的物質(zhì)為天然產(chǎn)物[11]。隨著微生物學(xué)的深入研究，越來越多的人關(guān)注研究微生物轉(zhuǎn)化合成天然2-苯乙醇[12,13]。自然界中多種酵母能夠通過艾氏途徑轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸合成2-苯乙醇的能力[14]，例如：2017年釀酒酵母 AS2.516 通過紫外誘變篩選出一株2-苯乙醇濃度達(dá)3.55 g/L的菌株[15]；2018年牛明福等篩選得到一株馬克斯克魯維酵母2-苯乙醇濃度達(dá)1.45 g/L的菌株[16]；2019年富志磊等從酒曲中篩選得到一株耐高溫季也蒙畢赤酵母合成2-苯乙醇濃度為1.66 g/L等[17]。

酵母菌生物轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇產(chǎn)物抑制是目前生物轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的瓶頸[18]，而2-苯乙醇和乙醇協(xié)同對酵母細(xì)胞的毒性大于其單個存在對細(xì)胞毒性的累加[19]。而篩選高耐受性且高產(chǎn)的菌株是從源頭上解決問題的途徑之一。本試驗從奶酪中分離純化酵母菌，通過菌株對2-苯乙醇的耐受性及轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的能力進(jìn)行研究，以期篩選出一株耐受性強轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的能力高酵母，為其在發(fā)酵食品中的應(yīng)用及提純行業(yè)提供了菌株來源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 奶酪樣品

取自新疆哈密市巴里坤哈薩克自治縣農(nóng)戶家的自制手工奶酪。

1.1.2 主要試劑

L-苯丙氨酸(BR)和2-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品(GC≥99%)：上海源葉生物科技有限公司；甲醇(GR)：賽默飛世爾科技有限公司；葡萄糖(AR)：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 主要儀器

LC-2010AHT型高效液相色譜儀 日本島津公司；ZWYR-D2403型恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；X7型多功能酶標(biāo)儀 基因有限公司。

1.1.4 固體培養(yǎng)基

蛋白胨20 g/L、酵母膏10 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L，121 ℃滅菌20 min。

1.1.5 種子培養(yǎng)基

蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母膏10 g/L，121 ℃滅菌20 min。

1.1.6 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基

葡萄糖35 g/L、酵母浸粉1.8 g/L、L-苯丙氨酸7 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO45 g/L、pH 5.0，11 ℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母菌的分離

參考Wolfe等的方法[20]，于無菌的條件下用滅過菌的工具從凝乳的奶酪表面取10 g樣品。將樣品放入含50 mL 0.9% NaCl溶液的滅菌管中，在振蕩器上20 ℃下振蕩30 min。在無菌的環(huán)境中將樣品梯度稀釋，每個稀釋梯度3個平行，移取100 μL于含有200 mg/L氯霉素的YPD固體培養(yǎng)基上用涂布棒涂布均勻，在28 ℃培養(yǎng)2 d[21]，從YPD平板上分離不同形態(tài)的酵母菌落純化3次，置于含20%甘油的甘油管中于-80 ℃低溫冰箱保存。

1.2.2 目標(biāo)菌株的選擇

據(jù)報道，酵母對2-苯乙醇的耐受性越好，其轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸合成2-苯乙醇的能力越強[22]。從分離純化凍藏的酵母菌甘油管中分別吸取100 μL于固體平板涂布均勻，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。挑取單菌落于滅過菌冷卻至室溫含10 mL液體的培養(yǎng)基試管中，于30 ℃，100 r/min 恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h，復(fù)接試管培養(yǎng)至對數(shù)期。通過生理鹽水和血球計數(shù)板制備成同一濃度菌液。分別吸取等量菌液于含0,1,2,3,4,5 g/L的2-苯乙醇固體平板中，每個菌株3個平行，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后觀察。

耐受2 g/L及以上的2-苯乙醇酵母菌株，同上制備成同一濃度菌液，分別接種等量菌液于滅過菌冷卻至室溫含0,1,2,3,4,5 g/L 2-苯乙醇50 mL液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，每個菌株3個平行。于30 ℃，240 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)36 h，每隔8 h取樣，以保存在4 ℃冰箱的接種后分別移取含有不同濃度2-苯乙醇的液體培養(yǎng)基為空白參比，用酶標(biāo)儀測定OD660值 。

1.2.3 酵母菌的鑒定

篩選獲得的高產(chǎn)2-苯乙醇耐受性菌株，以提取其基因組DNA為模板，使用引物NL1(NL15′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-TCCTCCGTCTATTGATATGC-3′)擴(kuò)增26S rDNA基因的D1/D2結(jié)構(gòu)域。PCR擴(kuò)增條件：于95 ℃初始變性5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 300 s，36個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。 擴(kuò)增產(chǎn)物于1.2% (W/V)瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離。使用Applied Bio Systems DNA Sequencer，mod獲得序列。通過比較GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列(來自http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST的BLASTN免費軟件)來鑒定菌株。

1.2.4 2-苯乙醇和乙醇能力的測定

由于2-苯乙醇和乙醇協(xié)同對酵母細(xì)胞的毒性大于其單個存在對細(xì)胞毒性的累加，考察了菌株產(chǎn)2-苯乙醇和乙醇的能力。從固體平板上挑取單菌落接入滅過菌的含50 mL液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在30 ℃，240 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，復(fù)接錐形瓶后培養(yǎng)至對數(shù)期。用血球計數(shù)板計數(shù)計算菌液濃度，并按需要的接種量接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，于30 ℃，240 r/min 恒溫?fù)u床培養(yǎng)36 h后測定2-苯乙醇和乙醇的含量。

取6 mL轉(zhuǎn)化液于4 ℃，6000 r/min下離心10 min后，吸取上清液經(jīng)0.45 μm過濾器過濾后進(jìn)行液相分析。2-苯乙醇含量測定的色譜條件: Agilent C18柱(4.6 mm×250 mm)；柱溫30 ℃；等梯度洗脫:甲醇∶超純水(60∶40)；流速1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，檢測波長260 nm。

參照重鉻酸鉀-DNS比色法測定發(fā)酵液中乙醇含量[23]。

1.2.5 乙醇和2-苯乙醇對酵母菌生長的抑制

向液體培養(yǎng)基中加入一定量乙醇和2-苯乙醇，控制乙醇的濃度分別為0，50，100，150 mL/L，2-苯乙醇的濃度分別為0，1，2，3，4，5 g/L。在含有不同濃度乙醇和2-苯乙醇的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中接入等量同一濃度的菌懸液，各自取少量置于冰箱做空白參比。于30 ℃，240 r/min 恒溫?fù)u床培養(yǎng)6 h后，用酶標(biāo)儀在660 nm處測定OD增長量。

1.2.6 酵母產(chǎn)2-苯乙醇培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

為最大限度提高酵母菌株產(chǎn)2-苯乙醇的量，考察培養(yǎng)基組分對轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇量的影響。L-苯丙氨酸：1.5，2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5，9.5，10.5，11.5 g/L；葡萄糖：60，70，80，90，100，110，120 g/L；酵母浸粉：0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 g/L；溫度：24，27，30，33，36，39 ℃。以上均在240 r/min，30 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)36 h，經(jīng)高效液相色譜測定2-苯乙醇。采用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計和分析。

2 試驗結(jié)果

2.1 目標(biāo)菌株的選擇

據(jù)報道，酵母對2-苯乙醇的耐受性越好，其轉(zhuǎn)化L-苯丙氨酸合成2-苯乙醇的能力越強。為得到產(chǎn)量較高的出發(fā)菌株，對從奶酪中分離純化的30株酵母菌進(jìn)行2-苯乙醇固體耐受性的考察和比較，篩選出相對高耐受性的酵母菌株，再對2-苯乙醇液體的耐受性及轉(zhuǎn)化產(chǎn)2-苯乙醇的能力進(jìn)行考察和比較，選出其中轉(zhuǎn)化能力和抗性最強的酵母菌株。

表1 耐受2 g/L及以上2-苯乙醇酵母固體平板生長情況

注:2-苯乙醇濃度單位為g/L，+代表菌株生長狀況，-代表菌株耐受極限，×代表完全不生長。上表為菌株生長2 d的情況。

通過固體耐受性試驗篩選得到7株能耐受2 g/L及以上2-苯乙醇濃度的菌株，由表1可知，菌株對2-苯乙醇的耐受性有較大差異。7株菌都能于1 g/L 2-苯乙醇固體培養(yǎng)基上生長，1號菌株生長明顯優(yōu)于對照菌株，可能少量2-苯乙醇促進(jìn)了菌株的修復(fù)功能，更加刺激了菌株的生長。1號和7號菌株于2 g/L 2-苯乙醇固體培養(yǎng)基中生長良好，而2號和3號菌株生長明顯受到抑制，4，5，6號菌株生長顯著受到抑制。7號菌株于3 g/L 2-苯乙醇固體培養(yǎng)基中的生長明顯受到抑制，而2號和3號菌株的生長完全受到抑制。

由表1可知，僅有1號和7號菌株能于4 g/L 2-苯乙醇固體培養(yǎng)基中生長。沒有菌株能耐受5 g/L 2-苯乙醇。

2-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)高效液相色譜檢測出峰時間約在7.5 min，目標(biāo)菌株發(fā)酵合成2-苯乙醇液相色譜圖見圖1。

圖1 菌株1轉(zhuǎn)化液2-苯乙醇HPLC圖譜

圖2 菌株轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇

由圖2可知，菌株1轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇濃度達(dá)2.51 g/L，明顯高于其他菌株，其次7號菌株合成2-苯乙醇濃度為2.06 g/L。

圖3 菌株對2-苯乙醇液體耐受性

由圖3可知，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中2-苯乙醇濃度大于3 g/L時，酵母菌株生長明顯受到抑制，達(dá)到5 g/L時，生長基本完全受到抑制。轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中2-苯乙醇濃度為3 g/L時，1，7號菌株分別抑制16.3%和22.8%細(xì)胞生長。2-苯乙醇濃度達(dá)4 g/L時，1，7號菌株分別有29.5%和21.1%細(xì)胞生長，通過固體和液體耐受性比較可以看出，1號菌株對2-苯乙醇的耐受性最好，2號菌株次之。因此，選擇對2-苯乙醇耐受最強、轉(zhuǎn)化合成能力最高的1號菌株作為后序試驗的目標(biāo)菌株。

2.2 菌株鑒定

圖4 基于1號菌株26S rDNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送檢獲得的基因序列于GeneBank進(jìn)行Blast比對，從中選擇序列相似度最相近的參比菌株，使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖4可知，該菌株經(jīng)比對為庫德里阿茲威氏畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)。

2.3 目標(biāo)菌株單因素優(yōu)化

以L-苯丙氨酸為主要碳源轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的艾氏途徑，是酵母轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的主要來源。適當(dāng)?shù)钠咸烟枪┙o菌株充足的能量，避免產(chǎn)生過多乙醇與2-苯乙醇協(xié)同抑制細(xì)胞生長。適量的酵母浸粉能為細(xì)胞生長提供所需微量元素和維生素。合適的溫度能保證轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇所需酶的活力，促進(jìn)菌株生長代謝和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的合成。因此，考察了葡萄糖、L-苯丙氨酸、酵母浸粉和溫度對轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的影響，試驗結(jié)果見圖5。

圖5 葡萄糖、L-苯丙氨酸、酵母浸粉和溫度對菌株1轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的影響

由圖5可知，葡萄糖濃度為70 g/L，L-苯丙氨酸濃度為6.5 g/L，酵母浸粉為1 g/L，溫度為30 ℃時，2-苯乙醇產(chǎn)量最高分別達(dá)2.62，3.17，3，2.7 g/L。通過單因素優(yōu)化，2-苯乙醇的產(chǎn)量從最初的2.51 g/L提升了0.66 g/L，達(dá)3.17 g/L。菌株于39 ℃仍能轉(zhuǎn)化合成1.5 g/L 2-苯乙醇，可見是一株耐熱性菌株。

2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果分析

2.4.1 響應(yīng)面分析試驗設(shè)計方案

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計，以對合成2-苯乙醇具有顯著影響的葡萄糖、L-苯丙氨酸和酵母浸粉為自變量，以2-苯乙醇濃度為因變量設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面分析試驗。試驗因素與水平的選取見表2，響應(yīng)面的試驗設(shè)計及試驗結(jié)果見表3。

表2 中心組合設(shè)計因素和水平

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

2.4.2 響應(yīng)面模型的建立及方差分析

采用Design Expert 8.0軟件對試驗所得數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項回歸擬合，得2-苯乙醇(Y)的二次回歸方程：Y=3.47349+0.067283X1+0.060664X2+0.10466X3-0.17582X1X2-0.13960X1X3-7.57000E-003X2X3-0.15023X12-0.17329X22-0.16861X32。

表4 回歸方差分析及顯著性檢驗

續(xù) 表

注：“*”表示差異顯著(P<0.05)；“**”表示差異極顯著(P<0.01)；R2=96.66%，RAdj2=92.37%。

由表4可知，該模型P<0.01差異極顯著，R2=0.9666，因素間交互作用存在顯著性差異。失擬項P=0.9573，不顯著，該模型調(diào)整后RAdj2=92.37%，表明該模型能解釋92.37%關(guān)鍵因子對菌株轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的影響，可用其確定轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的最佳工藝。

由表4各因素的P值可知，該回歸方程一次項X1和X2的P<0.05，差異顯著，X3的P<0.01，差異極顯著，3個因素對轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的影響順序為L-苯丙氨酸(X3)>葡萄糖(X1)>酵母浸粉(X2)。二次項X12、X22、X32、交互相X1X2和X1X3的P值均小于0.01，表明差異極顯著。

2.4.3 各因素交互作用的影響

回歸方程可用響應(yīng)面圖描述，能夠直觀反映各因素對響應(yīng)值的影響及各因素間交互作用的類型。由圖6和圖7可知，葡萄糖、酵母浸粉和L-苯丙氨酸對1號菌株轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的影響，并不是簡單的線性關(guān)系，具有交互作用。

圖6 酵母浸粉和葡萄糖交互作用對菌株1轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的影響

圖7 葡萄糖和L-苯丙氨酸交互作用對菌株1轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的影響

由圖6和圖7可知，葡萄糖和酵母浸粉及葡萄糖和L-苯丙氨酸交互作用響應(yīng)面圖呈拋物面形，等高線呈扁平的橢圓形表示兩者都有較強的交互作用。而酵母浸粉和L-苯丙氨酸有交互作用響應(yīng)面呈圓滑形，等高線呈圓形，表示交互作用不明顯[24,25]，故沒有陳列。結(jié)合表4的結(jié)果，交互項X1X2和X1X3試驗結(jié)果顯著性分析 P值均小于0.01，表明交互作用極顯著；而X2X3的P>0.05，表明交互作用不顯著，與圖6和圖7的結(jié)果一致。

上述回歸模型響應(yīng)面的最高點即為最佳值，等高線的圓心，也是菌株轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇最大值穩(wěn)定點，與其對應(yīng)的因素水平即為最優(yōu)工藝條件。采用Design Expert 8.0軟件計算得出1號菌株轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的最佳條件為：葡萄糖80 g/L、酵母浸粉1.2 g/L、L-苯丙氨酸7.5 g/L，在此優(yōu)化條件下，2-苯乙醇的理論值為3.47 g/L。通過試驗驗證1號菌株產(chǎn)2-苯乙醇與理論值貼近，達(dá)3.53 g/L，相比未優(yōu)化前產(chǎn)2.51 g/L 2-苯乙醇，提升了40.64% 2-苯乙醇的量，表明該模型有效。

2.5 乙醇和2-苯乙醇對菌株的抑制

因酵母發(fā)酵的副產(chǎn)物乙醇與2-苯乙醇協(xié)同對細(xì)胞的抑制作用比各自單獨存在抑制作用更強，且對菌株造成不可逆的影響?？疾炝?-苯乙醇和乙醇協(xié)同對1號菌株的抑制作用，見圖8。

圖8 乙醇和2-苯乙醇協(xié)同對菌株的抑制

于優(yōu)化后培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上，乙醇濃度經(jīng)測定為18.86 mL/L。由圖8可知，無2-苯乙醇條件下，乙醇濃度大于50 mL/L時嚴(yán)重抑制了菌株的生長，大于75 mL/L時，幾乎完全抑制菌株生長；無乙醇條件下，2-苯乙醇濃度為4 g/L時，仍有29.81%菌株生長。隨2-苯乙醇濃度遞增，乙醇濃度為25 mL/L的細(xì)胞生長趨勢較弱于乙醇濃度為0 mL/L的細(xì)胞生長趨勢。而該菌株產(chǎn)的乙醇較小于25 mL/L，與2-苯乙醇協(xié)同抑制細(xì)胞生長的作用不明顯。

3 結(jié)論

自然界中多種酵母具有合成2-苯乙醇的能力，不同種屬酵母或同種酵母不同菌株轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的能力各有差異。據(jù)報道，酵母對2-苯乙醇的耐受性越好，其轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的能力越高。從奶酪中分離純化的菌株，通過對2-苯乙醇固體耐受性初篩、液體耐受性復(fù)篩及高效液相色譜測定，獲得一株耐受性高、轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇能力強的菌株1，能于4 g/L的2-苯乙醇固體培養(yǎng)基中生長。通過單因素優(yōu)化和響應(yīng)面分析，確定其最優(yōu)培養(yǎng)基組分：葡萄糖80 g/L、酵母浸粉1.2 g/L、L-苯丙氨酸7.5 g/L、磷酸二氫鉀4 g/L和硫酸鎂0.8 g/L。此條件下，30 ℃培養(yǎng)24 h菌株轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇濃度達(dá)3.53 g/L；于39 ℃仍能合成1.5 g/L的2-苯乙醇。該菌株產(chǎn)生的乙醇和2-苯乙醇協(xié)同對細(xì)胞生長抑制作用不明顯，可忽略不計。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為庫德里阿茲威氏畢赤酵母。為后續(xù)轉(zhuǎn)化合成2-苯乙醇的研究奠定了基礎(chǔ)，為應(yīng)用生產(chǎn)天然2-苯乙醇提供了菌株來源。