響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取柿皮類胡蘿卜素及其體外抗氧化性研究

米雪，劉樹興，曾橋,2,3*，徐丹

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，西安 710021；2.陜西科技大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，西安 710021；3.陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院，西安 710021)

柿子樹為柿科柿屬落葉大喬木，生長在熱帶和溫帶地區(qū)。我國是柿子樹的主要種植區(qū)，柿子年產(chǎn)量占全世界的50%以上[1]，主要分布于陜西、山東、河南等地。柿子營養(yǎng)豐富，產(chǎn)量巨大，有數(shù)據(jù)表明，2016年我國柿子產(chǎn)量達(dá)396萬噸。柿子成熟后不易長期保存，除鮮食外，大部分被進(jìn)一步深加工制成柿餅、柿干、濃縮柿子汁等。柿皮是柿子深加工過程中的主要副產(chǎn)物，約占柿子重量的10%[2]，近年來，隨著柿子產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，因大量的柿皮未被有效地處理而對(duì)環(huán)境造成了較為嚴(yán)重的污染，越來越被大家重視。研究表明，柿皮中含有較多的多酚、膳食纖維、果膠物質(zhì)、單寧以及類胡蘿卜素等活性成分[3-5]，具有進(jìn)一步開發(fā)的潛力。綜合利用柿子皮，不僅可以提高柿子加工產(chǎn)品的附加值，而且可以實(shí)現(xiàn)柿子加工副產(chǎn)物的減量化和資源化，對(duì)于環(huán)境保護(hù)具有重要意義。

類胡蘿卜素是一系列化合物，是比較常見的自然色素的合稱[6]，為脂溶性色素，呈黃色、橙色和紅色[7]，只能由植物和微生物合成。研究表明，類胡蘿卜素的抗氧化和抗炎活性較好，具有增強(qiáng)免疫力[8]、抗癌、預(yù)防心血管疾病、保護(hù)視覺和防止老年性黃斑變性等功能[9]，是一種極具發(fā)展前途的功能性天然色素，可作為抗氧化劑、著色劑、膳食補(bǔ)充劑等用于食品和調(diào)味品中[10]。而柿皮中類胡蘿卜素含量較為豐富，為了充分利用這一資源，本文對(duì)柿皮中類胡蘿卜素的提取工藝和抗氧化活性進(jìn)行了研究，從而為我國豐富的柿皮資源化利用提供了理論依據(jù)，以期促進(jìn)柿子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柿皮：由富平永輝現(xiàn)代農(nóng)業(yè)柿子產(chǎn)業(yè)園提供。

β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、ABTS二胺鹽：上海源葉生物科技有限公司；碳酸氫二鈉、石油醚、碳酸二氫鈉、鐵氰化鉀、乙酸乙酯、抗壞血酸、無水乙醇、30%雙氧水、三氯化鐵：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；丙酮、水楊酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004N型電子分析天平 上海上天精密儀器有限公司；UV-1100型紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；600型電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；RE52CS-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；KH5200DE型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；GZX-9246MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將新鮮柿皮冷凍干燥，取出切成小塊，粉碎過20目篩，備用。

1.3.2 β-類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，溶解于丙酮中，定容至100 mL，制備成濃度為50 μg/mL的β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取5，10，15，20，25 mL標(biāo)準(zhǔn)液至50 mL容量瓶中，用丙酮定容，制備成濃度分別為5，10，15，20，25 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，在450 nm處測量吸光值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為Y=0.0227X+0.0048，R2=0.9996，線性關(guān)系良好。

1.3.3 類胡蘿卜素的提取

精確稱取柿子皮粉1 g，置于100 mL具塞三角瓶中，固定超聲功率為100 W，按一定液料比加入提取溶劑，在一定溫度下超聲輔助提取一定時(shí)間后，抽濾得柿皮類胡蘿卜素粗提液，定容，稀釋至一定倍數(shù)，在450 nm處測得吸光度值，進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，按(1)式計(jì)算類胡蘿卜素含量。

(1)

式中：C為類胡蘿卜素的濃度，μg/mL；V為溶液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

提取溶劑的選擇：固定液料比為20∶1 (mL/g)，提取溫度為50 ℃，超聲輔助提取40 min，分別考察丙酮、無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚作為提取溶劑對(duì)類胡蘿卜素提取率的影響。超聲溫度的選擇：用無水乙醇作為提取溶劑，固定液料比為20∶1 (mL/g)，超聲輔助提取40 min，分別考察提取溫度為30，40，50，60，70 ℃時(shí)對(duì)類胡蘿卜素提取率的影響。超聲時(shí)間的選擇：以無水乙醇作為提取溶劑，固定液料比為20∶1 (mL/g)，溫度為50 ℃，分別考察超聲提取時(shí)間為10，20，30，40，50 min時(shí)對(duì)類胡蘿卜素提取率的影響。液料比的選擇：以無水乙醇作為提取溶劑，固定超聲提取溫度為50 ℃，提取時(shí)間為40 min，分別考察液料比為15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 (mL/g)時(shí)對(duì)類胡蘿卜素提取率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，固定提取溶劑為無水乙醇，超聲功率為100 W，選擇超聲溫度、超聲時(shí)間和液料比3個(gè)因素，采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素和水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平表

1.3.6 柿皮中類胡蘿卜素抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.3.6.1 DPPH自由基清除活性測定[11]

精確稱取DPPH粉末5.0 mg，以無水乙醇為溶劑配制成0.05 mg/mL的DPPH對(duì)照溶液。于試管中依次加入質(zhì)量濃度分別為5，10，20，30，40，50 μg/mL的柿皮類胡蘿卜素溶液2.00 mL和DPPH溶液2.00 mL，震蕩均勻后在28 ℃下水浴30 min。以無水乙醇調(diào)零，于517 nm處測定吸光度，記為A樣品，用無水乙醇代替DPPH溶液按以上方法測定吸光度，記為A對(duì)照，用無水乙醇代替柿皮類胡蘿卜素提取液按以上方法測定吸光度，記為A空白。DPPH 自由基清除率計(jì)算公式如下：

(2)

1.3.6.2 ·OH清除活性測定[12]

于試管中依次加入6 mmol/L的FeSO4溶液2 mL，2 mL質(zhì)量濃度分別為5，10，20，30，40，50 μg/mL的柿皮類胡蘿卜素提取液，2 mL濃度為6 mmol/L的H2O2溶液，震蕩均勻，靜置10 min，加入2 mL濃度為6 mmol/L的水楊酸溶液并搖勻，靜置30 min，以蒸餾水調(diào)零，于510 nm 處測定各梯度濃度下溶液的吸光度，記為A樣品，按上述方法用蒸餾水代替柿皮類胡蘿卜素提取液測定吸光度，記為A空白，用蒸餾水代替水楊酸按上述方法測定吸光度，記為A對(duì)照，并按公式(3)計(jì)算·OH清除率，同時(shí)，以Vc作為陽性對(duì)照。

(3)

1.3.6.3 ABTS+清除活性測定[13]

于試管中依次加入質(zhì)量濃度為5，10，20，30，40，50 μg/mL柿皮類胡蘿卜素提取液0.5 mL，含ABTS+的溶液4.0 mL，靜置6 min。以無水乙醇調(diào)零，在734 nm處測定吸光度A樣品；用無水乙醇代替柿皮類胡蘿卜素提取液按以上方法測定吸光度A空白；Vc作為陽性對(duì)照。按下式計(jì)算ABTS+清除率：

(4)

1.3.6.4 還原力測定[14]

取質(zhì)量濃度分別為5，10，20，30，40，50 μg/mL的柿皮類胡蘿卜素提取液0.5 mL，依次加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，搖勻后置于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min，進(jìn)一步加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL、蒸餾水5 mL和0.1%氯化鐵溶液1 mL ，震蕩均勻后靜置10 min，以無水乙醇代替柿皮類胡蘿卜素提取液作空白對(duì)照，于700 nm波長處測定吸光度。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析方法

本文所有試驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)，數(shù)據(jù)為重復(fù)試驗(yàn)的平均值。響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行二次回歸分析及方差分析，其他試驗(yàn)結(jié)果均采用Origin 8.0軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 提取溶劑對(duì)柿皮類胡蘿卜素提取的影響

類胡蘿卜素具有疏水性，常使用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，常見的包括丙酮、氯仿、甲醇、乙醇、乙醚和己烷等，其中以丙酮和乙醇較佳[15]。

圖1 提取溶劑對(duì)柿皮類胡蘿卜素提取的影響

由圖1可知，不同提取溶劑對(duì)類胡蘿卜素提取效果的影響較為明顯，以無水乙醇作提取溶劑時(shí)，柿皮類胡蘿卜素含量最高；當(dāng)乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)，柿皮類胡蘿卜素含量最低。這是因?yàn)轭惡}卜素在不同的溶劑中具有不同的溶解度，因此提取效果也各不相同。無水乙醇作為常用溶劑，具有安全、成本低、粘性小、易回收等優(yōu)點(diǎn)。因此，合適的提取溶劑為無水乙醇。

2.1.2 超聲溫度對(duì)柿皮類胡蘿卜素提取的影響

圖2 超聲溫度對(duì)柿皮類胡蘿卜素提取的影響

由圖2可知，溫度逐漸升高，柿皮類胡蘿卜素含量先增加后減小。當(dāng)溫度升高至50 ℃時(shí)，類胡蘿卜素含量達(dá)到最大。溫度越高，分子熱運(yùn)動(dòng)越快，類胡蘿卜素溶解速率越快，但溫度過高，含量下降，這可能是由類胡蘿卜素的不穩(wěn)定性引起的，導(dǎo)致類胡蘿卜素活性喪失，乙醇的蒸發(fā)速率增加且能量消耗增加。綜合考慮，選取的超聲溫度為50 ℃，隨后的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)在40～60 ℃范圍內(nèi)進(jìn)行。

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)柿皮類胡蘿卜素提取的影響

圖3 超聲時(shí)間對(duì)柿皮類胡蘿卜素提取的影響

由圖3可知，柿皮類胡蘿卜素的含量隨超聲時(shí)間的增加而逐漸增加，在40 min達(dá)到最大值。進(jìn)一步延長提取時(shí)間，類胡蘿卜素含量反而下降，這可能是由于較長時(shí)間超聲波作用過程破壞了類胡蘿卜素[16]。因此，最佳超聲時(shí)間為40 min，后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)在30～50 min范圍內(nèi)進(jìn)行。

2.1.4 液料比對(duì)柿皮類胡蘿卜素提取的影響

圖4 液料比對(duì)柿皮類胡蘿卜素提取的影響

由圖4可知，柿皮類胡蘿卜素含量隨液料比的增加先增大后減小，在液料比30∶1 (mL/g)時(shí)，含量達(dá)到最大值，隨后呈現(xiàn)下降趨勢。因此，較佳液料比為30∶1 (mL/g)，后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)在液料比20∶1～40∶1 (mL/g)范圍內(nèi)進(jìn)行。

2.2 柿皮類胡蘿卜素提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

選取超聲溫度(A)、超聲時(shí)間(B)、液料比(C)進(jìn)行三因素三水平共17組Box-Behnken響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。方案設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)及結(jié)果

續(xù) 表

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性分析

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)柿皮類胡蘿卜素提取試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到以柿皮類胡蘿卜素含量為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程：

Y=-2.41+0.099A+0.073B+0.040C-8.555×10-4AB+2.075×10-5AC+2.900×10-5BC-5.627×10-4A2-3.800×10-4B2-5.237×10-4C2。

表3 響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析表

注：“*”表示差異顯著，P<0.05；“**”表示差異高度顯著，P<0.01；“***”表示差異極顯著,P<0.001。

由表3可知，模型的P值<0.001，表示回歸方程極顯著，失擬項(xiàng)P值為0.3311，不顯著，說明該模型能夠很好地?cái)M合試驗(yàn)數(shù)據(jù)?；貧w方程決定系數(shù)R2=0.9603，調(diào)整決定系數(shù)RAdj2=0.9094，表明回歸方程具有較好的擬合度。超聲溫度(A)、超聲時(shí)間(B)、液料比(C)的一次項(xiàng)均達(dá)到了顯著水平。影響因素由大到小順序?yàn)椋撼暅囟?超聲時(shí)間>液料比。此外，超聲溫度(A)和超聲時(shí)間(B)的交互作用、超聲溫度(A)、液料比(C)的二次項(xiàng)也達(dá)到了顯著水平。

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

響應(yīng)面曲面圖和等高線圖由Design Expert 8.0.6軟件繪制，各因素交互作用的響應(yīng)曲面圖和等高線圖見圖5。

圖5 各因素交互作用對(duì)類胡蘿卜素提取含量影響的響應(yīng)面和等高線圖

經(jīng)Design Expert軟件優(yōu)化，響應(yīng)面優(yōu)化模型預(yù)測柿皮類胡蘿卜素最佳工藝條件為：超聲溫度60 ℃，超聲時(shí)間30.29 min，液料比39.75∶1 (mL/g)，理論計(jì)算柿皮類胡蘿卜素提取的最大含量為2.63 mg/g，考慮到實(shí)際操作的可行性和方便性，將最佳工藝參數(shù)調(diào)整為超聲溫度60 ℃，超聲時(shí)間30 min，液料比40∶1 (mL/g)，在此條件下，進(jìn)行平行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)測含量為2.58 mg/g，與預(yù)測值誤差為1.9%，說明該模型對(duì)柿皮類胡蘿卜素提取工藝的優(yōu)化具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.3 柿皮類胡蘿卜素體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

2.3.1 對(duì)DPPH自由基的清除作用

圖6 柿皮類胡蘿卜素對(duì)DPPH自由基清除作用

由圖6可知，隨著濃度的增加，柿皮類胡蘿卜素和Vc對(duì)DPPH自由基的清除率增加，當(dāng)柿皮類胡蘿卜素質(zhì)量濃度大于20 μg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除效果略高于Vc，且進(jìn)一步提高柿皮類胡蘿卜素的濃度，其清除能力增加緩慢，當(dāng)柿皮類胡蘿卜素質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)96.5%，與同濃度下Vc的清除能力相當(dāng)，說明柿皮類胡蘿卜素清除DPPH自由基的能力較強(qiáng)。

2.3.2 對(duì)·OH的清除作用

圖7 柿皮類胡蘿卜素對(duì)·OH清除作用

由圖7可知，對(duì)·OH的清除率隨著柿皮類胡蘿卜素和Vc濃度的增加而增加，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到50 μg/mL時(shí)，柿皮類胡蘿卜素相較于Vc具有更好的清除能力，柿皮類胡蘿卜素對(duì)·OH的清除率為46.5%，而Vc僅為32%，且類胡蘿卜素對(duì)·OH的清除能力仍呈明顯上升趨勢，而Vc則較為緩慢。

2.3.3 對(duì)ABTS+的清除作用

圖8 柿皮類胡蘿卜素對(duì)ABTS+清除作用

由圖8可知，隨著柿皮類胡蘿卜素和Vc質(zhì)量濃度的增加，ABTS+清除率增加，當(dāng)柿皮類胡蘿卜素質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，其對(duì)ABTS+的清除率達(dá)93.4%，和相同濃度下的Vc清除能力相當(dāng)。結(jié)果表明，柿皮類胡蘿卜素清除ABTS+的能力較強(qiáng)。

2.3.4 還原力

圖9 不同質(zhì)量濃度柿皮類胡蘿卜素還原力

由圖9可知，柿皮類胡蘿卜素和Vc的還原力隨著質(zhì)量濃度的增加而增加，柿皮類胡蘿卜素的還原力明顯強(qiáng)于Vc，當(dāng)柿皮類胡蘿卜素質(zhì)量濃度為50 μg/mL時(shí)，吸光度為0.40，相同濃度下Vc的吸光度僅為0.17。

3 結(jié)論

響應(yīng)面優(yōu)化出柿皮中類胡蘿卜素的最佳提取工藝為：超聲功率100 W，提取溶劑為無水乙醇，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間30 min，液料比40∶1 (mL/g)，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得含量為2.58 mg/g，與理論計(jì)算柿皮中類胡蘿卜素的最大提取含量2.63 mg/g比較，誤差僅為1.9%，具有實(shí)用價(jià)值。體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)柿皮類胡蘿卜素濃度為50 μg/mL時(shí)，DPPH自由基的清除率為96.48%，略高于Vc；對(duì)ABTS+的清除率達(dá)93.35%，與Vc相當(dāng)；50 μg/mL柿皮類胡蘿卜素對(duì)·OH的清除率達(dá)46.54%，顯著高于Vc；50 μg/mL柿皮類胡蘿卜素對(duì)鐵的還原力為0.40，顯著高于Vc，說明柿皮類胡蘿卜素具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性。