響應(yīng)面法優(yōu)化樺菌芝三萜超聲提取工藝

黑育榮, 陳勝發(fā), 彭修娟,楊新杰

(1.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 陜西 楊凌 712100;2.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院,陜西 咸陽(yáng) 712046； 3.陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽(yáng) 712046)

樺菌芝 [Pyropolyporusfomentarius(L. ex Fr.)]又名木蹄、多寄生于樺樹(shù)及櫟樹(shù)的樹(shù)干上，樺菌芝的藥用活性之一是抗癌，民間治療子宮癌、食道癌、胃癌多有應(yīng)用[1,2,3]。目前對(duì)樺菌芝的研究，主要集中在樺菌芝多糖的抗癌作用機(jī)制[4]，樺菌芝的另一抗癌活性成分為三萜類成分[5]，對(duì)樺菌芝的三萜類成分的研究較少。筆者實(shí)驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化樺，菌芝三萜類成分的超聲提取工藝，給樺菌芝三萜的研究和開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

C2H5OH、濃H2SO4、HClO4、冰CH3COOH、醋酸酐、香草醛等(均為分析純)。樺菌芝(野生)；齊墩果酸對(duì)照品(110709-201607，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；

1.2 儀器

YP20002型電子天平，KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，DHG-9023A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，HH-2型電熱恒溫水浴鍋，SHZ-D(ш)型循環(huán)水用真空泵，UPT-I-10T型超純水機(jī)，UV-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 超聲提取樺菌芝三萜 準(zhǔn)確稱取樺菌芝粉末，置錐形瓶?jī)?nèi)，以設(shè)定濃度的乙醇溶液和料液比，設(shè)定超聲溫度、時(shí)間，進(jìn)行提取，過(guò)濾得提取液，測(cè)定濾液中樺菌芝三萜的含量，并計(jì)算三萜的得率。

1.3.2 對(duì)照品溶液的配制 稱取適量齊墩果酸對(duì)照品，加入一定體積的甲醇，配制成0.1953 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色，以可見(jiàn)分光光度法測(cè)定總?cè)坪縖6]，分別吸取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL的對(duì)照品溶液，分揮干，加入0.2mL 5%香草醛冰乙酸和0.8mL高氯酸，60℃水浴中反應(yīng)15 min，冰水浴冷卻, 加冰乙酸定容到5 mL，同法作為空白，測(cè)定550 nm處的吸光度值。以齊墩果酸(mg)x為橫坐標(biāo)，吸光度值(A)y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 樺菌芝三萜含量測(cè)定 準(zhǔn)確量取樣品液1 mL，置25 mL具塞試管中，揮干溶劑按香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色法顯色，平行測(cè)定3次。

1.3.5 單因素實(shí)驗(yàn) 分別考察50%，60%，70%，80%，90%的乙醇濃度，在40℃、50℃、60℃、70 ℃、80℃的條件下超聲，分別設(shè)定10 min、15 min、20 min、25 min、30 min的超聲時(shí)間，以1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的料液比，對(duì)樺菌芝提取液中三帖類物質(zhì)含量的影響。

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化 分別以乙醇濃度、溫度，時(shí)間和料液比為因素，以三萜得率為響應(yīng)值，以Box-Benhnken的原理，進(jìn)行響應(yīng)面分析。

1.3.7 分析數(shù)據(jù) 用Design-Expert.8.0.6.1軟件分析數(shù)據(jù)

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1，回歸方程為：Y =8.8208X + 0.1157，R2=0.9998。

圖1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對(duì)三萜得率的影響 由圖2中可以看出，乙醇濃度為50%～70%之間，三萜得率隨著濃度增加逐漸增大，當(dāng)濃度增大到70%時(shí)三萜得率最大。因此，最佳醇乙濃度為70%。

圖2 乙醇濃度對(duì)三萜得率的影響

2.2.2 提取溫度對(duì)三萜得率的影響 從圖3可知，隨著溫度的升高三萜得率逐漸增大。溫度達(dá)到70℃時(shí)，三萜得率增加至最大。由70℃到80℃，三萜得率呈下逐漸下降。過(guò)高溫度可能會(huì)對(duì)三萜的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞從而影響提取率。經(jīng)分析得出：提取溫度應(yīng)選擇70℃。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)三萜得率的影響 從圖4可以看出，在10～15 min，三萜得率緩慢增加，時(shí)間為15 min時(shí)增加至最高值，而在15～30 min之間，三萜得率呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢(shì)，可以得出，提取時(shí)間控制在15 min左右較為適宜。

圖3 提取溫度對(duì)三萜得率的影響

圖4 提取時(shí)間對(duì)三萜得率的影響

2.2.4 料液比對(duì)三萜得率的影響 從圖5可以看出，料液比為1∶15時(shí)三萜得率最大，故本次實(shí)驗(yàn)的料液比控制在1∶15。

圖5 料液比對(duì)三萜得率的影響

2.3 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 按照單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box-Benhnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理，進(jìn)行4因素3水平實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素及水平

2.3.2 回歸模型方程建立與方差分析 以樺菌芝提取液中三帖得率為指標(biāo)，依據(jù)Box-Behnken響應(yīng)曲面法超聲提取樺菌芝三萜的工藝優(yōu)化，得到設(shè)計(jì)的29組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用軟件Design-Expert.8.0.6.1進(jìn)行分析，得到回歸模型方程：

R1=-29.02533+0.47512A+0.31737B+0.32043C+0.37260D-3.25×10-4AB+1.00×10-5AC-1.5×10-3AD-5.50×10-4BC+4.2×10-3CD+6×10-3CD-3.0675×10-3A2-2.505×10-3B2-0.01247×C2-0.021720D2

回歸分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸模型的方差分析

通過(guò)表2數(shù)據(jù)分析可知，此模型的F值是2.99，方程的“Prob> F”數(shù)值小于0.05，表明相應(yīng)因素對(duì)響應(yīng)值影響顯著。從回歸方程的方差與分析結(jié)果看出，該方程的失擬項(xiàng)特別小，說(shuō)明方程對(duì)實(shí)驗(yàn)的擬合情況良好。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)果分析均可表明該模型用于優(yōu)化三萜類物質(zhì)的提取工藝是非?？煽康?。

2.3.3 響應(yīng)面法分析 應(yīng)用Design-Expert.8.0.6.1軟件繪制乙醇濃度、超聲提取溫度、超聲提取時(shí)間、料液比等因素交互作用對(duì)樺菌芝提取液三萜類物質(zhì)含量影響的響應(yīng)曲面圖和等值線圖，結(jié)果詳見(jiàn)圖6,續(xù)圖6。

圖6 提取液中三萜類物質(zhì)含量各因素交互作用影響的響應(yīng)面與等值線

續(xù)圖6 提取液中三萜類物質(zhì)含量各因素交互作用影響的響應(yīng)面與等值線

根據(jù)Design-Expert 8.0.6.1 Trial軟件對(duì)模型方程計(jì)算得到：乙醇濃度70.33%、提取溫度在69.67℃，提取時(shí)間15.20 min料液比為1∶14.98理論值為3.97%。

2.3.4 驗(yàn)證 應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中工藝設(shè)定為：乙醇濃度70%、超聲提取溫度70℃、超聲提取時(shí)間15 min料液比為1∶15。在此條件下，平行實(shí)驗(yàn)三次，實(shí)際測(cè)得樺菌芝三萜得率為3.87%，相比模型的提取率降低了約0.09%左右。由此證明，筆者實(shí)驗(yàn)所得最優(yōu)提取工藝實(shí)用可行。

3 結(jié)論

以乙醇濃度、超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比四個(gè)因素進(jìn)行單因素水平實(shí)驗(yàn)，然后通過(guò)Box-Behnken原理設(shè)計(jì)，建立出模型，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到超聲提取樺菌芝三帖最優(yōu)工藝條件：乙醇濃度70%，超聲溫度70℃，超聲時(shí)間15 min，料液比1∶15。在最佳工藝條件下重復(fù)平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果樺菌芝三萜平均取率為3.87%。筆者試驗(yàn)的理論數(shù)據(jù)可以為實(shí)際的樺菌芝三萜提取工藝優(yōu)化和工業(yè)生產(chǎn)所參考。