新型熒光探針應用于帕金森病模型中NO的檢測

楊流海,陳江寧,張峻峰

(南京大學生命科學學院 醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點實驗室,江蘇 南京 210093)

大量的研究表明,NO在帕金森病(PD)發(fā)生過程中發(fā)揮了重要的作用。NO可以誘發(fā)氧化應激，導致細胞線粒體功能紊亂；NO也可以介導興奮性神經(jīng)毒性作用，并引發(fā)細胞中DNA和蛋白質(zhì)不可逆的修飾損傷，最終導致神經(jīng)元的死亡[1- 2]。

為了深入地研究NO在PD發(fā)生與發(fā)展過程中的具體作用，就需要對神經(jīng)系統(tǒng)NO進行專一性的檢測。NO具有很強的反應活性和不穩(wěn)定性，直接進行PD中NO的檢測非常困難。目前檢測NO的方法有化學反光法、電子順磁共振譜(EPR)法和電化學法等，這些方法普遍存在靈敏度低、準確性差、儀器復雜、成本昂貴等不足。相比較而言，熒光測定法是目前NO檢測方法中較為靈敏的化學檢測手段，檢測下限一般可達到納摩爾(10-9)甚至皮摩爾(10-12)，并且操作簡單、成本低，具有較高的選擇性和靈敏度[3]。文獻報道的許多小分子熒光探針都只能通過與NO的氧化產(chǎn)物進行反應間接反映NO的變化。我們課題組報道了一種新型的熒光化合物 4- 甲氧基- 2- (1- 氫- 萘- [2，3- d]咪唑- 2- 基)苯酚(4- methoxy- 2- (1H- naphtho[2，3- d]imidazol- 2- yl)phenol，MNIP)，該化合物與二價銅離子形成的銅(Ⅱ)配合物(MNIP- Cu)能夠?qū)Ｒ恍缘嘏c生物系統(tǒng)中的NO發(fā)生反應，造成熒光的極大增強，從而對神經(jīng)細胞或活體腦內(nèi)的NO進行熒光成像，這為我們研究NO在PD發(fā)病機制的具體作用機制提供了新的手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 熒光化合物MNIP由本實驗室自己合成，1- 甲基- 4- 苯基吡啶/1- 甲基- 4- 苯基- 1，2，3，6- 四氫嘧啶(MPP+/MPTP)、7- 硝基吲唑(7- NI)、多巴胺(DA)標準品、花生油(peanut oil)、二甲亞砜(DMSO)購自美國Sigma- Aldrich公司，Mitotracker? Red cm- h2xros購自美國Invitrogen公司，硫酸銅(CuSO4)為市售分析純試劑，30%雙氧水(H2O2)購自南京生興生物技術(shù)有限公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco- BRL公司(Grand Island， NY，USA)，新生牛血清購自杭州四季青生物公司，胰蛋白酶購自美國Hyclone公司。

1.1.2 主要儀器 F- 4500 model spectrophotometer(Hitachi， Tokyo， 日本)，Nikon TE2000- U 熒光相差顯微鏡 (Tokyo， 日本)，Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡，Aglient1200液相色譜儀 (Santa Clara， 美國)，Leica 冰凍切片機 (Wetzlar，德國)，數(shù)字式腦立體定位儀，Safire 酶標儀 (TECAN Co. Mannedorf， Zurich，瑞士)。

其他設備還包括: 二氧化碳細胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺、Eppendorf 5810R 離心機、-20 ℃冰箱和-80 ℃低溫冰箱，6、12、96孔細胞培養(yǎng)板為Costar公司產(chǎn)品。

1.1.3 實驗細胞系與動物 人神經(jīng)母細胞瘤株SH- SY5Y細胞購于中國科學院上海細胞庫，雄性C57/BL小鼠(6～8周，18～20 g)購自中國軍事科學院。

1.2 方法

1.2.1 NO熒光探針MNIP- Cu的制備 MNIP為本實驗室自己合成，合成方法參考相應文獻[4]，MNIP結(jié)構(gòu)式見圖1。MNIP以DMSO配成濃度為1 mmol·L-1的溶液，40 mmol·L-1的硫酸銅溶液被緩慢滴加到MNIP溶液中，滴加的最終摩爾比為MNIP∶Cu2+=1∶1，混合后溶液在室溫下攪拌30 min，得到濃度為1 mmol·L-1的MNIP- Cu溶液，即NO熒光探針，此熒光探針檢測NO的有關機理及檢測專一性請參考相應文獻[5]。

圖1MNIP結(jié)構(gòu)圖

Fig1StructurechartofMNIP

1.2.2 熒光探針MNIP- Cu對細胞NO的熒光成像 SH- SY5Y細胞以4×104個·ml-1的密度接種至6孔細胞培養(yǎng)板，等細胞貼壁過夜后加入500 μmol·L-1MPP+刺激24 h，然后加入MNIP- Cu(終濃度為10 μmol·L-1)和線粒體特異性染料MitoTracker Red(終濃度為200 nmol·L-1)共孵育30 min，然后采用Olympus FV1000激光共聚焦顯微鏡進行細胞熒光照片的拍攝(放大1 000倍)，拍攝前吸除舊培養(yǎng)液，以預冷的4 ℃ 1×PBS洗滌細胞后再進行拍攝。同時設置兩個陰性對照組，1個陰性對照為預先用7- NI(終濃度30 μmol·L-1)處理細胞1 h，然后再加入毒素刺激細胞24 h，接著加入探針進行熒光照片的拍攝；另1個陰性對照為細胞受到毒素刺激24 h后加入終濃度為500 μmol·L-1的NO清除劑3- 氧代- 2- 苯基- 4，4，5，5- 四甲基咪唑啉- 1- 氧(PTIO)處理細胞30 min，然后再加入探針進行熒光照片的拍攝。MNIP- Cu和MitoTracker Red的激發(fā)波長分別為405 nm和578 nm[6]。

1.2.3 PD動物模型的制作 40只雄性C57/BL小鼠(約20 g重)被隨機分為3組，分籠飼養(yǎng)，8只為空白對照組(Control組)，24只為模型組(MPTP組)，又細分為MPTP連續(xù)注射3、7、10 d 3個亞組，8只為陰性對照組(7- NI組)。給予自由進食和飲水，室溫維持在25 ℃，保持動物正常的12 h光照，所有動物的處理均符合南京大學實驗動物操作管理規(guī)范。MPTP溶解在PBS中，7- NI溶解在花生油中。在模型組中，3、7和10 d組小鼠腹腔分別連續(xù)3、7和10次注射MPTP(溶解在100 μl PBS中)，每次注射的時間間隔為24 h，每次注射劑量為30 mg·kg-1。在陰性對照組中，小鼠按照模型組同樣的時間間隔和劑量腹腔注射MPTP，但每次注射MPTP前30 min先皮下注射7- NI(溶解在200 μl的花生油中)，劑量也為30 mg·kg-1。空白對照組中小鼠皮下注射200 μl的花生油，30 min后皮下注射100 μl PBS，連續(xù)注射10 d，時間間隔也為24 h[7]。在最后1次MPTP注射后第4天完成以下實驗。

1.2.4 小鼠行為學參數(shù)的檢測 開放場地實驗(open filed test)被廣泛地應用于動物行為學方面的研究，而PD患者或動物模型在行為學上都表現(xiàn)出異常。開放場地實驗裝置為一個25 cm×25 cm×31 cm的亞克力盒隔音箱，底部由25個5 cm×5 cm大小的方格組成，整個裝置置于JLBehv- LAM- 1自動監(jiān)控系統(tǒng)的監(jiān)測中。在安靜的環(huán)境下將小鼠放入隔音箱中，監(jiān)控系統(tǒng)自動記錄下20 min內(nèi)小鼠的移動距離(locomotion)和休息的時間(immobile time)。每組檢測8只小鼠的行為學參數(shù)，在測完1只小鼠的行為學參數(shù)后用棉花將小鼠殘留在隔音箱底部的糞便和尿液擦干凈[8]。

1.2.5 小鼠腦內(nèi)多巴胺濃度的檢測 最后1次注射MPTP后4 d迅速斷頸處死小鼠(每組處死4只)，然后取出腦子，加入600 μl預冷的高氯酸溶液(0.1 mol-1)勻漿，然后15 000 r·min-1離心20 min，取上清液通過高效液相色譜(HPLC)法檢測小鼠多巴胺的濃度水平。

1.2.6 MNIP- Cu對小鼠腦部NO的熒光檢測 小鼠麻醉后將其牢牢地固定在腦立體定位儀上，通過數(shù)字式腦立體定位儀為每組另外的4只小鼠腦室注入10 μl的MNIP- Cu溶液(濃度為1 mmol·L-1)，進樣速度為1 μl·min-1。2 h后處死小鼠，迅速取出完整的腦子，其中每組取1個腦子放置于-20 ℃進行冰凍，冰凍后腦組織浸于OCT復合物(optimum cutting temperature compound)中處理1 h，處理后的腦組織以Leica冰凍切片機切成30 μm厚的薄片，置于預先處理的潔凈的載玻片上，每片載玻片上加入1 ml左右4 ℃預冷的丙酮進行組織固定。固定1 h后，冰凍切片以Olympus IX71相差熒光顯微鏡在100倍的放大倍數(shù)下以350 nm激發(fā)光進行熒光照片的拍攝。每組的另外3只小鼠腦子加入800 μl預冷的DMSO勻漿，然后15 000 r·min-1離心15 min，連續(xù)離心2次，各取上清液200 μl在酶標儀上以350 nm激發(fā)檢測熒光強度，同時取少量的上清液測定蛋白濃度，對熒光強度數(shù)值歸一化。

2 結(jié) 果

2.1 PD細胞模型中NO的熒光成像

細胞在受到MPP+刺激后線粒體功能會受到損傷，氧化磷酸化作用受到抑制，同時NO等自由基大量產(chǎn)生而造成氧化應激，導致細胞凋亡。圖2所示SH- SY5Y細胞在受到MPP+刺激后NO(藍色熒光信號)的生成量明顯增加，并且藍色熒光信號主要集中在線粒體(紅色熒光信號)區(qū)域，可見MPP+刺激SH- SY5Y細胞后主要導致細胞線粒體NO濃度的升高。7- NI能夠抑制NO合酶(NOS)的活性，PTIO可以直接清除NO，兩者都能抑制細胞內(nèi)NO引發(fā)的熒光增強效應。

2.2 小鼠行為學參數(shù)的檢測

圖3顯示PD模型小鼠的運動能力受到了顯著損傷，同時在開放場里的不動時間(休息時間)是逐漸延長的。小鼠行為學損傷具有MPTP劑量依賴性，MPTP注射次數(shù)越多，小鼠行為學損傷越嚴重。而神經(jīng)性一氧化氮合酶(nNOS)的特異性抑制劑7- NI對MPTP的毒性具有較強的抵御作用，能明顯改善小鼠的這種狀況，表明NO在這個過程中發(fā)揮了重要的作用。

2.3 MPTP抑制小鼠腦內(nèi)多巴胺的合成

圖4顯示小鼠在注射MPTP后其多巴胺的合成受到了抑制，并且抑制作用具有MPTP劑量依賴性，小鼠注射MPTP 3、7和10 d后，其多巴胺的濃度依次下降到正常水平的64.70%、21.81%和15.07%。而7- NI對多巴胺合成系統(tǒng)具有明顯的保護作用，能夠顯著減緩多巴胺濃度的減少，小鼠在受到7- NI保護后即使再注射10次的MPTP，其多巴胺的濃度依然可以達到正常水平的92.92%。

2.4 MNIP- Cu應用于PD模型小鼠中NO的熒光檢測

圖5顯示注射了MPTP的小鼠腦切片的熒光強度顯著增大，并且隨著MPTP注射次數(shù)的增多，熒光強度逐漸增大。說明MPTP能夠誘導小鼠腦部過度合成NO，而7- NI能夠顯著抑制MPTP對NO的上調(diào)作用。腦勻漿熒光檢測的結(jié)果與熒光照片的結(jié)果是一致的。熒光強度的大小與NO的含量成正比，因此熒光強度的變化直接代表了NO濃度的變化。小鼠注射MPTP 3、7和10 d后，大腦內(nèi)NO的濃度依次升高到正常水平的1.49、1.64和2.38倍。而7- NI能夠抑制腦內(nèi)NO濃度的升高，小鼠在注射了7- NI后再注射10 d的MPTP，其NO的濃度僅升高到正常水平的1.23倍。

圖2MPP+刺激的細胞中MNIP-Cu對NO的熒光成像

Fig2FluorescentimagingofMNIP-CuonMPP+stimulatedcells

圖3MPTP誘導小鼠行為學的損傷

Fig3MPTPinducebehaviorinjuryinmice

圖4MPTP抑制小鼠腦部多巴胺的合成

Fig4MPTPinhibitdopaminesynthesisinmicebrain

3 討 論

本研究顯示PD小鼠腦內(nèi)NO的合成發(fā)生顯著上調(diào)，同時小鼠的運動機能受到損傷，腦內(nèi)多巴胺的合成也受到顯著抑制。隨著MPTP注射次數(shù)的增多，小鼠腦內(nèi)NO的濃度逐漸上升，而小鼠的運動能力逐漸下降，腦內(nèi)多巴胺的濃度也逐漸降低；使用NO抑制劑后小鼠的運動能力逐漸上升，腦內(nèi)多巴胺的濃度逐漸升高?？梢娦∈筮\動能力受損及腦內(nèi)多巴胺濃度的減少確實是由于高濃度的NO導致的，推測可能是由于NO濃度過高具有神經(jīng)毒性，通過多種途徑導致多巴胺能神經(jīng)元的死亡，從而使多巴胺的濃度顯著減少，同時運動機能受到嚴重損傷。PD的典型癥狀就是運動機能受損和大腦多巴胺水平的下降，可見我們這樣一個體系確實模擬了PD的發(fā)病過程，可用于PD發(fā)病機理的研究。細胞學的研究還進一步表明PD的發(fā)生與線粒體的功能及氧化應激有著密切的關聯(lián),該研究為PD的治療與診斷提供了新的線索。

圖5MNIP-Cu應用于MPTP誘導的PD模型小鼠中NO的熒光檢測

Fig5MNIP-CuusedinNOfluorescentdetectiononMPTP-inducedPDmicemodel

本研究首次將新型NO熒光探針MNIP- Cu應用于PD的研究領域，直接檢測到NO生成量的改變，該探針專一性強、反應靈敏，為闡明NO在PD發(fā)病機制中的作用提供了新的研究手段。

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