PGPR復(fù)合菌系對(duì)花生生長(zhǎng)及根際土壤微生物的影響

劉 暢，黃文茂，韓麗珍,2*

(1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽(yáng) 550025)

【研究意義】化肥的使用是農(nóng)作物獲得高產(chǎn)的重要手段之一，但過(guò)度施用又會(huì)導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境惡化，不利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。土壤微生物在土壤無(wú)機(jī)、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物地球化學(xué)循環(huán)以及維持土壤健康和品質(zhì)方面都起著非常重要的作用[1]。以有益微生物為主的新型生物肥的研究與應(yīng)用日益受到世界各國(guó)的重視[2]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物根際是根系表面和貼近根周圍的狹窄區(qū)域，是土壤、根系及微生物三者相互作用的區(qū)域[3]，根際中的相互作用在土壤有限養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和溶解等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。植物根部與根際有益微生物的互作是植物健康和土壤肥力的決定因素。在植物根際環(huán)境中定植的細(xì)菌即為“根際細(xì)菌”[4]，從植物根際土壤中分離出的有益細(xì)菌往往具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)和提高產(chǎn)量的作用，這類細(xì)菌被稱為植物根際促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)[5]。迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)的根際促生菌的促生作用不盡相同，其促生機(jī)理尚未完全確定。多數(shù)植物根系促生菌的促生效果基于植株-土壤-微生物互作，即通過(guò)生物固氮、增加根際營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有效性、誘導(dǎo)根表面積增加等達(dá)到對(duì)植物的促生目的[6]。植物根際促生菌既能通過(guò)溶磷、生物固氮及解鉀直接發(fā)揮促生作用，也可通過(guò)活躍土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)而間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前已有大量根際促生菌分離及植物促生試驗(yàn)的報(bào)道，但鮮有促生菌對(duì)植株-土壤-微生物整個(gè)體系影響的研究。前期已經(jīng)在茶樹(shù)根際土壤中分離、篩選得到4株分屬不同種屬的根際促生菌：P9為束村氏屬、P10為伯克霍爾德氏菌屬、GD3為假單胞菌屬及GD12為芽孢桿菌屬，初步研究表明，P9和P10菌株是具溶磷固氮能力的優(yōu)良促生菌菌株，GD3和GD12具有解鉀能力，且GD12也有一定的固氮性能[7-8]。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】花生是我國(guó)重要的油料作物，種植面積僅次于油菜和大豆[9]。為促進(jìn)植物根際促生菌在花生生產(chǎn)上應(yīng)用，以具溶磷固氮功能的P9和P10菌株為主體菌株，分別與具解鉀能力的GD3和GD12兩兩組合配制成兼有固氮、溶磷、解鉀功能的復(fù)合菌系，通過(guò)對(duì)花生幼苗進(jìn)行灌根處理，測(cè)定不同處理組花生的生理及生長(zhǎng)性狀、花生土壤的氮磷鉀含量，監(jiān)測(cè)根際土壤的功能菌群數(shù)及土壤酶活性，從植物-土壤-微生物的角度綜合分析復(fù)合菌系對(duì)花生的促生機(jī)理，旨在為下一步利用這4株根際促生菌制備菌肥提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 土壤采集 土壤均來(lái)源于貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)貴州大學(xué)南校區(qū)(N26°42′48″，E106°67′31″)，取樣地海拔1114 m，取距離土壤表面20～30 cm的壤土，將采集的土壤過(guò)篩(<2 mm)滅菌后用于盆栽試驗(yàn)。土壤理化指標(biāo)：pH 5.47，有機(jī)質(zhì)29.01 g/kg，全氮176 g/kg，全磷0.518 g/kg，堿解氮 346 mg/kg，速效鉀262 mg/kg，有效鐵8.47 mg/kg。

1.1.2 供試菌株 4株植物根際促生菌均從茶樹(shù)根際分離得到，分別為GD3(假單胞菌屬，Pseudomonashunanensis)、GD12(芽孢桿菌屬，Bacillusflexus)、P9(束村氏屬，Tsukamurellasp.)和P10(伯克霍爾德氏菌屬，Burkholderiasp.)[7-8]。

1.1.3 供試作物 供試花生選用貴州本地花生，市購(gòu)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以具有溶磷固氮功能的P9和P10菌株為主體菌株，分別與具有解鉀能力的GD3和GD12兩兩組合配制成兼有固氮、溶磷、解鉀功能的4個(gè)復(fù)合菌系處理組，即P9+GD3、P9+GD12、P10+GD3和P10+GD12，開(kāi)展PGPR復(fù)合菌系對(duì)花生生長(zhǎng)及根際土壤微生物影響的盆栽試驗(yàn)。

1.2.2 復(fù)合菌系制備 供試菌株P(guān)9、P10、GD3和GD12分別活化后，接種于LB液體培養(yǎng)基中搖床振蕩培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌水調(diào)節(jié)OD600=1.0的菌懸液。按試驗(yàn)設(shè)計(jì)，等體積混合不同菌株菌懸液以制備復(fù)合菌系備用。

1.2.3 盆栽試驗(yàn) 試驗(yàn)于2017年7月14日開(kāi)始，將花生種子用20 %過(guò)氧化氫溶液浸泡20 min進(jìn)行表面消毒，無(wú)菌水多次沖洗后置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，待種子生根后，將其轉(zhuǎn)入盆中；待生長(zhǎng)1周后，選取長(zhǎng)勢(shì)相近的花生幼苗用于試驗(yàn)。盆栽試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)復(fù)合菌系處理組及1個(gè)對(duì)照組，每組6株幼苗。處理組每隔2 d用菌液灌根1次，每次5 mL；對(duì)照組每隔2 d施5 mL LB培養(yǎng)基。常規(guī)管理30 d后收集幼苗植株、花生根際土壤分別進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 植株生理生長(zhǎng)指標(biāo)及土壤理化性質(zhì)測(cè)定 測(cè)定花生幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)包括的株高、鮮重等。生理指標(biāo)選擇葉綠素含量，采用Arnon法測(cè)定。土壤理化性質(zhì)包括有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮、全磷、速效鉀及有效鐵，分別采用重鉻酸鉀氧化容量法、凱氏法、堿解擴(kuò)散法、鉬銻抗比色法、火焰分光光度法及原子光譜法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 根際土壤功能菌群數(shù)測(cè)定 功能菌群主要涉及氮循環(huán)相關(guān)功能菌群、溶磷菌以及解鉀菌等，其中，氮循環(huán)功能菌群選擇了氨化細(xì)菌、硝化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌及自生固氮菌，分別以蛋白胨氨化培養(yǎng)基、亞硝酸氧化細(xì)菌培養(yǎng)基、氨氧化細(xì)菌培養(yǎng)基、硝酸還原培養(yǎng)基以及阿須貝無(wú)氮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)[10-11]，無(wú)機(jī)溶磷菌采用NBRIP培養(yǎng)基培養(yǎng)[12]，解鉀菌采用亞歷山大硅酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)[13]。固氮菌、溶磷菌及解鉀菌的計(jì)數(shù)采用稀釋涂布平板法，氨化細(xì)菌、硝化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌的計(jì)數(shù)采用最大或然值法[14]。

1.2.6 根際土壤酶活的測(cè)定 根際土壤中脲酶、過(guò)氧化氫酶酶活測(cè)定采用關(guān)松蔭的方法[15]，蔗糖酶活測(cè)定采用魏元的方法[16]，中性磷酸酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的酶活測(cè)定參照吳金水的方法[14]。

1.3 統(tǒng)計(jì)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0進(jìn)行LSR法多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 PGPR復(fù)合菌系對(duì)花生幼苗生長(zhǎng)的影響

從表1看出，經(jīng)PGPR復(fù)合菌系灌根處理的花生幼苗株高顯著高于對(duì)照(P<0.05)，其中P9+GD3、P9+GD12、P10+GD3和P10+GD12處理的株高分別較對(duì)照高27.40 %、24.88 %、35.27 %和37.60 %，P10+GD12處理的花生株高顯著高于P9與GD3及GD12組合的處理。在不同復(fù)合菌系處理間花生幼苗鮮重差異不顯著，但均顯著高于對(duì)照(P<0.05)。此外，復(fù)合菌系處理與對(duì)照的花生植株葉綠素含量差異不顯著。綜合花生幼苗生理及生長(zhǎng)情況，PGPR復(fù)合菌系對(duì)花生生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，尤其以P10+GD12處理的促生效果最明顯，其次為P10+GD3菌系處理。說(shuō)明，P10菌株的促生作用優(yōu)于P9菌株。

2.2 PGPR復(fù)合菌系對(duì)花生土壤養(yǎng)分的影響

對(duì)不同處理土壤的理化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)， 4個(gè)PGPR復(fù)合菌系處理的速效鉀含量顯著高于對(duì)照(P<0.05)，其中，P10+GD3和P10+GD12處理土壤的速效鉀含量分別比對(duì)照高1.56和1.38倍。PGPR復(fù)合菌系處理的土壤氮含量有一定程度的提高，P10+GD3和P10+GD12處理的全氮和堿解氮含量顯著高于對(duì)照(P<0.05)，其中，堿解氮含量P10+GD3和P10+GD12處理分別較對(duì)照高64.36 %和43.40 %，全氮含量分別比對(duì)照高25 %和21 %。此外，經(jīng)4個(gè)復(fù)合菌系處理后，土壤有機(jī)質(zhì)、全磷和有效鐵含量較對(duì)照均有不同程度提高，但差異不明顯。說(shuō)明PGPR復(fù)合菌系處理能明顯提高土壤氮、鉀營(yíng)養(yǎng)水平，其中以P10為主體菌株的組合處理優(yōu)于P9菌株的組合。

表1 不同PGPR復(fù)合菌系處理的花生幼苗生理生長(zhǎng)指標(biāo)

注：同列不同小寫(xiě)字母表示不同處理間差異水平顯著(P<0.05)，下同。

Note: Different letters in the same column indicate significant difference at 5 % level. The same as below.

表2 不同PGPR復(fù)合菌系處理的花生土壤理化性質(zhì)

表3 不同PGPR復(fù)合菌系處理的花生根際土壤功能菌群數(shù)量

2.3 PGPR復(fù)合菌系對(duì)花生根際土壤功能菌群的影響

氮循環(huán)相關(guān)的功能菌群包括氨化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌、硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌及自身固氮菌。從表3看出，P10+GD12處理花生根際土壤氮循環(huán)功能菌群除固氮菌外均顯著高于P9+GD12、P9+GD3和CK處理(P<0.05)，氨化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌、硝化細(xì)菌及反硝化細(xì)菌的數(shù)量分別較對(duì)照高36.98、22.09、39.67及15.56倍。自身固氮菌以P9+GD12處理組最高，而P10+GD12處理的自身固氮菌數(shù)量較對(duì)照高8.25倍(P<0.05)。

測(cè)定結(jié)果顯示，解磷菌數(shù)量P10+GD3處理與對(duì)照相比差異顯著，P10+GD3處理較對(duì)照高7.71倍(P<0.05)；其他處理組的解磷菌數(shù)量均高于對(duì)照，但差異不顯著。復(fù)合菌系處理顯著提高根際土壤中解鉀菌數(shù)量，尤以P10+GD12處理組最明顯，較對(duì)照高13.23倍(P<0.05)。

2.4 PGPR復(fù)合菌系對(duì)花生根際土壤酶活的影響

PGPR復(fù)合菌系處理使根際土壤酶活性發(fā)生改變。從圖1看出，復(fù)合菌系澆灌后，根際土壤中的脲酶酶活較對(duì)照顯著增高，其中以P10+GD3的處理效果最佳，較對(duì)照高2.48倍，并顯著高于其余處理。過(guò)氧化氫酶酶活復(fù)合菌系處理較對(duì)照均顯著提高，其中P10+GD12的組合最明顯，較對(duì)照提高1.74倍。蔗糖酶活除P10+GD3處理較對(duì)照顯著增高外，其余處理較對(duì)照均有所降低，但差異不顯著。磷酸酶包括中性、酸性和堿性磷酸酶，測(cè)定結(jié)果表明，酸性磷酸酶活性最高，中性磷酸酶次之，堿性磷酸酶活性最低。堿性磷酸酶活PGPR復(fù)合菌系處理與對(duì)照無(wú)明顯差異；中性、酸性磷酸酶酶活以P10+GD12處理最高，顯著高于其余處理。

小寫(xiě)字母表示顯著水平(P<0.05)Different lowercase letters indicate significant difference at 5 % level圖1 不同PGPR復(fù)合菌系處理的花生根際土壤酶活性Fig.1 Enzyme activities of peanut rhizosphere soil treated with different compound flora

3 討 論

目前對(duì)于根際促生菌的研究主要關(guān)注根際促生菌自身的促生作用及菌株的生理特征[17]。王同等[18]報(bào)道利用茶園土中篩選到的溶磷菌蘇云金芽孢桿菌B1，接種花生發(fā)現(xiàn)可以很好地在土壤中定殖，并顯著提高土壤有效磷含量。從披堿草根際土壤分離到具固氮活性的003PWXZ6菌株，接種披堿草后顯著促進(jìn)其株高和生物量，且在根際有一定的定殖能力[19]。目前，綜合分析根際促生菌對(duì)于植物的促生影響、對(duì)土壤肥力指標(biāo)的提高、對(duì)土壤特定功能微生物及土壤酶活性影響的研究仍很少。土壤微生物作為土壤的重要生物因子，在為植物提供養(yǎng)分過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，其可通過(guò)改變植物根系生理和根際環(huán)境，直接影響植物獲得養(yǎng)分的能力，而非根際土壤中的養(yǎng)分循環(huán)如生物固定和礦化分解、硝化和反硝化等過(guò)程都離不開(kāi)微生物的參與。土壤微生物是土壤肥力形成和持續(xù)發(fā)展的核心動(dòng)力[20]，參與土壤氮循環(huán)的微生物主要有氨化細(xì)菌、自生固氮菌、亞硝化細(xì)菌、硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌，可以調(diào)節(jié)和平衡氮元素在土壤中的轉(zhuǎn)化[21]。其中，含氮有機(jī)物如蛋白質(zhì)、尿素、尿酸及核酸等經(jīng)氨化細(xì)菌的氨化作用而產(chǎn)生的氨對(duì)提供農(nóng)作物氮素營(yíng)養(yǎng)十分重要[22]，自生固氮菌進(jìn)行的生物固氮是土壤中有效性氮素的最主要來(lái)源[23]，磷和鉀以無(wú)機(jī)或有機(jī)狀態(tài)存在于土壤中，無(wú)法被植物直接吸收，大量的難溶性磷鉀甚至導(dǎo)致土壤結(jié)構(gòu)惡化[24]。解磷菌和解鉀菌則可將不溶性磷和鉀轉(zhuǎn)換為可供植物吸收的可溶性磷和速效鉀，改善土壤結(jié)構(gòu)，甚至提高作物的抗病性[25]。研究表明，在花生生長(zhǎng)過(guò)程中施用PGPR復(fù)合菌系后，根際土壤中包括自生固氮菌、氨化細(xì)菌、亞硝化細(xì)菌、硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌的氮循環(huán)功能菌群、解磷菌和解鉀菌數(shù)量均有不同程度的提高，表現(xiàn)出促生菌處理使土壤微生物活動(dòng)更為活躍。邱勤等[26]利用PGPR菌(包括根瘤菌、聯(lián)合固氮菌、硅酸鹽細(xì)菌和巨大芽孢桿菌)接種紫花苜蓿后顯著增加土壤細(xì)菌、真菌、放線菌、根瘤菌、硅酸鹽細(xì)菌和固氮菌數(shù)量，土壤基本化學(xué)肥力指標(biāo)明顯提高。

土壤酶活性反映土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化能力及總生物活性，是評(píng)價(jià)土壤肥力的重要指標(biāo)，可在一定程度上反映土壤的健康狀況[27]。脲酶酶促產(chǎn)物氨是植物氮源之—，直接參與土壤氮素循環(huán)，與土壤有機(jī)質(zhì)含量及微生物數(shù)量有關(guān)[28]。過(guò)氧化氫酶通過(guò)促過(guò)氧化氫的分解有利于防止其對(duì)生物體的毒害作用，其酶活活性與土壤有機(jī)質(zhì)含量有關(guān)[29]。蔗糖酶對(duì)增加土壤中易溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)起著重要作用，蔗糖酶與土壤許多因子有相關(guān)性，如與土壤有機(jī)質(zhì)、氯、磷含量、微生物數(shù)量及土壤呼吸強(qiáng)度有關(guān)[30]。磷酸酶參與土壤中有機(jī)磷的轉(zhuǎn)化，與土壤碳、氮及有機(jī)磷含量相關(guān)[31]。呂雅悠等[32]利用普城沙雷菌A21-4接種辣椒后顯著提高辣椒植株莖粗，根際土壤過(guò)氧化氫酶、脲酶和磷酸酶活性顯著提高，土壤速效氮磷鉀含量較對(duì)照有不同程度的增加，根際土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量增加，真菌數(shù)量降低。試驗(yàn)結(jié)果表明，花生幼苗接種PGPR復(fù)合菌系后除蔗糖酶活性和中性磷酸酶活性變化不明顯外，接種組的脲酶、過(guò)氧化氫酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶均較對(duì)照有不同程度的提高，微生物活躍代謝也是土壤中氮、鉀含量顯著提高的原因。

研究表明，根際促生菌復(fù)合菌系的加入不僅直接促進(jìn)花生幼苗的生長(zhǎng)，同時(shí)導(dǎo)致根際土壤中的功能菌群結(jié)構(gòu)、酶活甚至土壤理化性質(zhì)的改變。有研究發(fā)現(xiàn)，作物生長(zhǎng)旺盛期的根系土壤中解磷菌數(shù)量明顯高于其他時(shí)期[33]，表明作物的生理活動(dòng)也會(huì)影響根際土壤中微生物群落的改變。顯然，PGPR復(fù)合菌系對(duì)花生幼苗的促生是植株-微生物-土壤整個(gè)體系相互作用的結(jié)果，對(duì)這一體系的進(jìn)一步研究將極大地幫助理解根際促生菌對(duì)于植株的促生原理，對(duì)于不同作物土壤、菌肥的選擇都有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

4 結(jié) 論

研究以具溶磷固氮的Tsukamurellasp. P9和Burkholderiasp. P10為主體菌株，分別與具有解鉀能力的PseudomonashunanensisGD3及BacillusflexusGD12兩兩組合，獲得同時(shí)兼有解鉀、解磷和固氮作用的4個(gè)PGPR復(fù)合菌系P9+GD3、P9+GD12、P10+GD3和P10+GD12。花生幼苗的盆栽試驗(yàn)顯示，經(jīng)4個(gè)復(fù)合菌系灌根的處理均可促進(jìn)花生的生長(zhǎng)，這種促生作用是通過(guò)提高土壤的氮磷鉀含量，促進(jìn)土壤氮循環(huán)菌群、溶磷菌及解鉀菌等功能微生物的活化、促進(jìn)土壤脲酶、過(guò)氧化氫酶和中性磷酸酶的水平而發(fā)揮效應(yīng)的，尤以P10+GD12復(fù)合菌系組合表現(xiàn)出最強(qiáng)的促生效應(yīng)。與對(duì)照(未進(jìn)行PGPR復(fù)合菌系處理)相比，P10+GD12復(fù)合菌系處理的花生株高和鮮重分別提高37.60 %和63.90 %，土壤堿解氮和速效鉀提高64.36 %和1.38倍，根際土壤的氨化細(xì)菌、自生固氮菌及解鉀菌分別增加36.98、8.25和13.23倍，根際土壤脲酶增加2.48倍。因此，利用根際促生菌的功能構(gòu)建多功能復(fù)合菌系可有效促進(jìn)花生幼苗生長(zhǎng)，提高土壤養(yǎng)分含量，改善根際土壤環(huán)境，為下一步復(fù)合菌劑的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。