魚類抗菌肽研究進(jìn)展（二）

劉洪巖，薛暉，張世勇，王江，趙沐子，陳校輝，邊文冀

（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017）

3 Hepcidin

Hepcidin是一種富含半胱氨酸的多肽，最先在人源的hepcidin中發(fā)現(xiàn)其具有抗菌活性。此后，hepcidin在許多其他的脊椎動(dòng)物被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，包括爬行類，兩棲類和魚類。在魚類中，hepcidin最先從雜交條紋鱸中發(fā)現(xiàn)，目前至少已經(jīng)在37種魚類中鑒定到了該抗菌肽[1]。Hepcidin一般是一個(gè)由4個(gè)二硫橋形成harpin-折疊，包含8個(gè)半胱氨酸，然而魚hepcidin序列分析表明，魚類hepcidin只含有4，6或7個(gè)半胱氨酸[2]。

魚類hepcidin基因在進(jìn)化過程中發(fā)生了重復(fù)和多樣化的過程中，產(chǎn)生了多重基因拷貝的，最多能達(dá)到八個(gè)之多[2]。Hepcidin基因由3個(gè)外顯子和內(nèi)含子編碼一個(gè)信號肽，一個(gè)端功能前區(qū)和成熟肽。Hepcidin RNA轉(zhuǎn)錄的肽段大小的范圍可以從81到96個(gè)氨基酸，而成熟的hepcidin只有19～31個(gè)氨基酸，與分子量約2～3 kDa。hepcidin的等電點(diǎn)一般8以上，因此，hepcidin是陽離子抗菌肽。不過也有例外，如預(yù)測斜帶石斑魚的hepcidin等電點(diǎn)只有5.4[3]。

魚有兩種 hepcidin，hamp1和 hamp2。然而，hamp1在輻鰭魚和非輻鰭魚中都有發(fā)現(xiàn)，而hamp2只在輻鰭魚中有發(fā)現(xiàn)。此外，系統(tǒng)發(fā)育研究顯示hamp2存在正向選擇（但hamp1和哺乳動(dòng)物中同源的基因卻不存在），這表明不同的環(huán)境中的適應(yīng)性進(jìn)化可能與宿主和病原體的相互作用有關(guān)。

與其他抗菌肽基因類似，魚類hepcidin可以由革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌誘導(dǎo)表達(dá)。此外，釀酒酵母、腫瘤細(xì)胞系如L-1210和SAF-1也可以誘導(dǎo)hepcidin的表達(dá)。魚類hepcidin基因也可以由病毒或聚I∶C以及有絲分裂原誘導(dǎo)表達(dá)。此外，環(huán)境雌激素內(nèi)分泌干擾物β-雌二醇下調(diào)大口黑鱸肝臟hepcidin 亞型基因的表達(dá)[1，2，4]。

人類的hepcidin是II型急性期相關(guān)蛋白，細(xì)菌感染后的表達(dá)時(shí)序證明，hepcidin的表達(dá)高峰在發(fā)生在細(xì)菌感染后3～6 h以及腐爛發(fā)生時(shí)[5]。虹鱒感染魯爾耶爾森氏菌后，hepcidin伴隨著感染急性期反應(yīng)蛋白如IL-1β，血清淀粉樣蛋白A和小腦肽的前體上調(diào)表達(dá)。因此hepcidin可以作為II型急性期蛋白，參與到魚類廣泛的先天免疫反應(yīng)中。

魚hepcidin抑菌普非常廣，對于革蘭氏陽性菌和陰性菌的抑制濃度都在微米范圍內(nèi)，而且對大量魚類病原菌的活性很強(qiáng)，例如能夠殺死帶鞭毛的金黃色葡萄球菌和假單胞菌[5]。此外，hepcidin和moronecidin能夠協(xié)同作用抑制S.iniae和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌[6]。并且，hepcidin對多種病毒起作用，人類的Hepc25能夠誘導(dǎo)STAT3活化，導(dǎo)致抗病毒通路開啟，從而抑制HCV病毒在細(xì)胞中的復(fù)制[7]。很少有研究能夠闡明hepcidin對細(xì)菌的作用機(jī)制。在對人類的Hepc25研究中發(fā)現(xiàn)，與大多數(shù)抗菌肽不同，hepcidin作用于細(xì)菌時(shí)，并沒有發(fā)生膜通透性的改變，同時(shí)凝膠阻滯試驗(yàn)證明，人類的Hepc25可以與DNA高效結(jié)合[8]。魚類hepcidin中也有類似的試驗(yàn)結(jié)果。光發(fā)射動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)表明重組hepcidin前體、合成hepcidin同樣不會(huì)引起大腸桿菌膜通透性[5]。

魚hepcidin也具有抑制癌細(xì)胞生存的能力。例如，羅非魚hepcidin TH2-3，表現(xiàn)出濃度依賴方式抑制人纖維肉瘤細(xì)胞株HT1080a的增殖和遷移。此外，TH2-3能夠引起HT1080細(xì)胞膜破壞，并且能夠下調(diào)c-Jun基因表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。TH1-5能夠調(diào)節(jié)免疫相關(guān)基因的表達(dá)，并且能夠在低劑量時(shí)抑制腫瘤細(xì)胞（HeLa、HT1080 和 HepG2）生長，改變膜的結(jié)構(gòu)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞中，加入25 μM合成的Om-hepcidin或者5 μM合成的Omhepcidin前體，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞存活率下降40%，與omhep1相比，pro-omhep1具有更好的抗HepG2細(xì)胞活性[9]。

魚hepcidin能夠調(diào)節(jié)不同的免疫相關(guān)基因的表達(dá)。TH1-5轉(zhuǎn)基因的斑馬魚能夠上調(diào)IL-10、IL-21、IL-22、溶菌酶的表達(dá)；TLR-1、TLR-3 上調(diào)斑馬魚TNF-α、NF-κB等基因的表達(dá)。然而，TH2-3則起到TH1-5的拮抗作用。對多寶魚的研究已經(jīng)表明，hepcidin能夠增加炎性細(xì)胞因子NF-κB的活性[10]。TH2-3也能夠在小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞中調(diào)節(jié)蛋白激酶C的表達(dá)，而且還能夠誘導(dǎo)細(xì)胞在形態(tài)上產(chǎn)生類似于PMA誘導(dǎo)的變化[11]。此外，在病毒引起的胰腺壞死感染的中，TH1-5調(diào)節(jié)某些干擾素和膜聯(lián)蛋白的表達(dá)。

盡管具有抗菌和免疫調(diào)節(jié)作用，hepcidin最關(guān)鍵作用是運(yùn)鐵素的調(diào)節(jié)因子。運(yùn)鐵素可以通過內(nèi)吞作用降解，這樣能夠減少血液對鐵元素的吸收。雖然在魚類中這種作用還沒有被證實(shí)，但是hepcidin具有調(diào)節(jié)鐵元素的能力。它也可以作為其他的二價(jià)金屬的受體，如果暴露在其他二價(jià)金屬如銅和鎘，hepcidin的表達(dá)水平會(huì)上調(diào)。

4 Cathelicidins

與其他抗菌肽不同，cathelicidins成熟肽之間的同源性并不高。它們有著保守的前體肽N端區(qū)域，叫作cathelin結(jié)構(gòu)域，成熟的有活性的抗菌肽由前體肽經(jīng)過蛋白酶解后釋放[12]。在哺乳動(dòng)物中，不僅在不同物種間，即使在同一物種中，成熟的cathelicidin序列也存在很大的變化。總的來說，所有的哺乳動(dòng)物cathelicidin成熟肽是陽離子抗菌肽，具有雙親性特征，在體外具有廣譜抗菌活性?？梢酝ㄟ^主要氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，在C-末端有區(qū)顯著的序列相似性，具有很強(qiáng)的陽離子并且富含甘氨酸。

魚類中第一個(gè)cathelicidins來自大西洋盲鰻抗菌肽的分離，從編碼這些肽的cDNA序列分析，發(fā)現(xiàn)它們具有同源性，這與哺乳動(dòng)物中cathelins是相同的。根據(jù)有無二硫鍵，魚cathelicidin分為兩種類型。研究魚cathelician發(fā)現(xiàn)一個(gè)高度的同源區(qū)域，這個(gè)區(qū)域似乎比哺乳動(dòng)物中cathelin結(jié)構(gòu)域更保守，成熟肽序列具有明顯的同源性（90%），而不同類別之間的同源性較小。此外，最近在鱈魚中發(fā)現(xiàn)了第三類cathelicidins，它們之間具有很高的同源性，但是與其它兩種類相比較缺乏同源性[13]。

由不同物種提純的cathelicidin，其體外抗菌活性表現(xiàn)出顯著的差異性。例如，鱈魚的cathelicidin對革蘭氏陰性菌具有較高活性但是對革蘭氏陽性菌幾乎不起作用，同時(shí)它還對白色念珠菌有很強(qiáng)的殺傷作用。與此相反，盲鰻cathelicidins對革蘭氏陰性菌和陽性菌都有很強(qiáng)的作用，但對白色念珠菌的作用很弱[14]。虹鱒魚cathelicidins對Y.ruckeri的作用很強(qiáng)，而大西洋鮭魚cathelicidins對Y.ruckeri并沒有作用[15]。成熟肽序列的差異直接導(dǎo)致了抗菌活性的差異，可能是由于進(jìn)化過程中，對抗的病原不同而產(chǎn)生的進(jìn)化分歧。

基于其抗菌活性，cathelicidin在體內(nèi)的作用機(jī)理和表達(dá)模式基本上已經(jīng)研究清楚。抗菌肽的表達(dá)一般都是應(yīng)答病原刺激，如細(xì)菌和病原相關(guān)分子，而抗菌肽又能進(jìn)一步調(diào)節(jié)機(jī)體免疫。重要的是，cathelicidin在早期胚胎中就發(fā)現(xiàn)有表達(dá)，這說明它參與機(jī)體最早期的免疫。在體外培養(yǎng)的鮭魚胚胎中，細(xì)菌和細(xì)菌的DNA都足以誘導(dǎo)cathelicidin的表達(dá)，這表明像哺乳動(dòng)物一樣，魚的cathelicidin在宿主防御細(xì)菌中發(fā)揮類似的作用，但是純化的LPS并不能誘導(dǎo)所有魚類的cathelicidin基因表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這與基因變異有關(guān)。大鱗鮭魚的胚胎細(xì)胞就可以被I∶C、LPS、細(xì)菌的鞭毛蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，而在虹鱒巨細(xì)胞中cathelicidin可以被先天免疫反應(yīng)的重要介質(zhì)IL-6誘導(dǎo)表達(dá)。此外，細(xì)菌及其產(chǎn)物可以誘導(dǎo)鱒魚細(xì)胞系cathelicidin基因的表達(dá)[16]。體內(nèi)研究進(jìn)一步支持了這一假說。當(dāng)香魚注射活菌后，會(huì)在鰓、肝、脾、腸等組織中，時(shí)間依賴性的表達(dá)cathelicidin[17]。此外，大西洋鮭魚和虹鱒感染Y.ruckeri后誘導(dǎo)抗菌肽cathelicidin的表達(dá)。大西洋鮭魚的鰓與殺鮭氣單胞菌孵育3 h之后可以產(chǎn)生cathe licidin，但是與鰻弧菌孵育則不能誘導(dǎo)cathelicidin表達(dá)。這表明抗菌肽cathelicidin在宿主防御中發(fā)揮作用的機(jī)制是復(fù)雜的[13]。

哺乳動(dòng)物抗菌肽已被證明具有多種活性，其免疫和非免疫活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過他們的體外抗菌活性。然而cathelicidin在魚類中的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于這一水平。最近的一項(xiàng)研究表明，兩種大西洋鮭魚catheli cidins可以快速、短暫的誘導(dǎo)外周血白細(xì)胞表達(dá)IL-8[18]。這表明cathelicidin的免疫調(diào)節(jié)活性在哺乳動(dòng)物和魚類中是相似的，這可能是一種進(jìn)化上保守先天免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。

5 魚類抗菌肽的應(yīng)用價(jià)值

所有抗菌肽特點(diǎn)都在理論上支持其發(fā)展成為治療藥物，包括廣譜抗菌活、生化穩(wěn)定性以及不產(chǎn)生耐藥性。魚類抗菌肽的特征更是為其應(yīng)用提供了無限可能?？傮w來說，魚類抗菌肽和其他物種的抗菌肽對于人源的病原體作用范圍幾乎相同，但是，它們對魚類病原體更加有效，因?yàn)樗鼈兒芸赡芘c病原體一起進(jìn)化。

由于很多抗菌肽在高鹽度環(huán)境中都是不穩(wěn)定的，來自于海洋魚類的抗菌肽就可以補(bǔ)充這一缺陷。例如pleurocidin可以在300 mM NaCl環(huán)境中保持類似于其他piscidian的活性[19]?；谶@種特性，pleurocidin可以被用于高鹽度的環(huán)境，如血清，眼膜高滲血癥等。除了抗菌藥物，一些魚類抗菌肽還具有體外抑制多種癌細(xì)胞的作用。

Piscidian已經(jīng)被開發(fā)成多種藥物了。例如，口服或注射epinecidin-1能顯著提高斑馬魚和石斑魚感染弧菌后的生存[20]；轉(zhuǎn)染epinecidin-1的斑馬魚和石斑魚在弧菌和無乳鏈球菌感染時(shí)，肌肉顯著減少創(chuàng)傷[21]。此外，用epinecidin-1治療耐甲氧西林金葡菌（MRSA）感染的小鼠，能夠通過降低細(xì)菌數(shù)目增加小鼠存活率，并且增加小鼠傷口的愈合和血管的生成[22]。epinecidin-1可以用于制造滅活病毒疫苗。注射epinecidin處理過的乙型腦炎老鼠病毒（JEV）后，感染病毒時(shí)小鼠的存活率可達(dá)到100%，其性能優(yōu)于福爾馬林滅活的乙腦病毒疫苗。這是因?yàn)閑pinecidin可以調(diào)節(jié)免疫相關(guān)基因，包括增加血清中抗JEV的抗體，從而抑制病毒在腦中的復(fù)制[18]。

魚hepcidin用于藥物處于試驗(yàn)階段。其中羅非魚hepcidin TH2-3孵育過的創(chuàng)傷弧菌，能夠增強(qiáng)感染和再感染時(shí)小鼠的存活率。TH2-3的抑制創(chuàng)傷弧菌的效果比四環(huán)素更好，并且在血腦屏障和肝臟中，也有同樣的結(jié)果。

魚類抗菌肽作為藥物使用，阻礙其進(jìn)一步發(fā)展的因素包括血清不穩(wěn)定性，多肽合成費(fèi)用高，以及蛋白酶不穩(wěn)定性。研究者也在探索解決這些問題的方法，包括找出更小的片段，如抗菌肽的活性部位，可能會(huì)表現(xiàn)出更好的活性，以及與常規(guī)的抗生素連用，通過協(xié)同作用降低傳統(tǒng)抗生素的使用濃度，從而降低細(xì)菌抗藥性的產(chǎn)生。

6 總結(jié)

魚類抗菌肽在結(jié)構(gòu)，基因組成和功能上都是非常多變的，也因此提供給我們一個(gè)豐富的抗菌肽庫。它們可以為更好地設(shè)計(jì)新型的治療劑提供重要信息，既可用于治療微生物感染，也可用于治療癌癥和其他病原菌感染。魚類抗菌肽的很多特點(diǎn)使其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值。特定的魚抗菌肽對魚類病原體有很強(qiáng)的活性，同時(shí)一些病原體在魚體內(nèi)誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)時(shí)會(huì)產(chǎn)生抗菌肽，這種復(fù)雜的關(guān)系表明抗菌肽機(jī)體是與病原體抗?fàn)幍漠a(chǎn)物，并且與病原體一同進(jìn)化。綜上所述，抗菌肽為魚類的宿主防御提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，并且這些肽及其衍生物具有作為藥物開發(fā)的潛力。