藥用植物內(nèi)生菌的多樣性及其活性代謝產(chǎn)物功能研究進(jìn)展

黃 磊 高燕燕 許才萬(wàn) 曾亞軍*

(1 貴州省林業(yè)科學(xué)研究院 貴陽(yáng) 550005；2 貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 貴陽(yáng) 550025)

近年來(lái)，受國(guó)內(nèi)外研究者的持續(xù)關(guān)注，植物內(nèi)生菌已成為多個(gè)領(lǐng)域研究中的熱點(diǎn)，它存在于植物的健康組織內(nèi)并與宿主互惠共生、協(xié)同進(jìn)化，是一類形態(tài)種類各異的微生物類群。然而由于研究者的研究角度不同，對(duì)植物內(nèi)生菌定義的概念也有所不同。國(guó)際上對(duì)植物內(nèi)生菌的界定，尚有不同的意見，De Bary于1866年的定義是：生活在植物體組織內(nèi)的所有生物體，包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和放線菌等微生物，用于區(qū)別生活在植物組織表面的表生物(Epiphyte)[1]，Bacon于1988年、Petrini于1991年將其定義為：只要來(lái)自外表健康的植物體內(nèi)的真菌或細(xì)菌即內(nèi)生菌[2～3]，國(guó)際植物病理學(xué)會(huì)于1998年對(duì)其定義：在植物體內(nèi)完成其生活史的部分或全部,但又不引起任何病癥的微生物[4]，這次的定義已經(jīng)著重關(guān)注內(nèi)生菌在宿主體內(nèi)的生活史。目前，業(yè)界普遍認(rèn)為植物內(nèi)生菌(Endophytes)是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物不同組織和器官的內(nèi)生真菌或細(xì)菌，被感染的宿主植物不表現(xiàn)出外在癥狀[5]。

植物內(nèi)生菌在植物生命過程中有著著重要的作用，自Vogl于1898年成功從黑麥草(Loliumtumelentum)的種子中分離得到第一株內(nèi)生真菌以來(lái)[6]，已有越來(lái)越多的科研工作者從不同植物中分離得到不同種類的植物內(nèi)生菌。多年來(lái)，不同研究領(lǐng)域的眾多研究成果既豐富了內(nèi)生菌種類，也加深了我們對(duì)內(nèi)生菌的認(rèn)識(shí)。植物內(nèi)生菌作為一種重要的微生物資源，是新型天然活性物質(zhì)的重要來(lái)源之一，不但可以產(chǎn)生萜類、黃酮類、內(nèi)酯類、酚類、多肽類等與宿主植物相類似的生物活性物質(zhì)[7～8]；而且對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝、應(yīng)對(duì)生物脅迫等方面也具有重要作用[9]。目前已有數(shù)百種植物內(nèi)生菌的相關(guān)研究，本文主要回顧國(guó)內(nèi)外部分藥用植物內(nèi)生菌的多樣性及其活性代謝產(chǎn)物的應(yīng)用研究。

1 植物內(nèi)生菌的多樣性

1.1 內(nèi)生菌在植物中分布的多樣性

植物內(nèi)生菌在植物中的分布具有多樣性，它分布于大部分植物組織中，尤以植物表皮下的組織中居多，近幾十年來(lái)，已從不同植物的莖、種子、胚珠、胚根、葉及其它植物儲(chǔ)藏器官內(nèi)分離得到大量?jī)?nèi)生菌，從針葉植物、草本植物、栽培植物、蕨類植物的樹皮、枝葉、根、原球莖中均成功分離得到內(nèi)生菌[10～11]，可見植物內(nèi)生菌的分布部位趨于多樣化。柴曉蕾等[12]以海南特有藥用植物華石斛野生植株為材料，從其根、莖、葉中分離獲得不同種屬內(nèi)生菌，發(fā)現(xiàn)葉中分離的菌株數(shù)最多，有些類群具有一定的組織偏好性。

一般而言，在植物生長(zhǎng)的不同階段，其內(nèi)生菌種類也具有差異，因此分離內(nèi)生菌時(shí)可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同生長(zhǎng)時(shí)期的植物。如蘭科具有較高的觀賞和藥用價(jià)值，雖然從成年植物根、莖、葉中能夠分離得到多種內(nèi)生菌，但從中分離得到的內(nèi)生菌常常不能促進(jìn)種子萌發(fā)，許多科研人員正嘗試從原球莖中分離促進(jìn)種子萌發(fā)的內(nèi)生菌。

1.2 植物內(nèi)生菌種類的多樣性

植物內(nèi)生菌種類繁多，并在各種陸生、水生低等植物和高等植物中廣泛分布，種類主要包括內(nèi)生真菌、細(xì)菌和放線菌[13～14]。研究表明，植物內(nèi)生菌種類和分布在不同地域、不同宿主植物、不同組織部位中具有較大差異。篩選分離植物內(nèi)生菌步驟基本分為：消毒、清洗、接種、培養(yǎng)、分離。其中，消毒可以考慮使用醫(yī)用酒精、雙氧水、適當(dāng)濃度次氯酸鈉等表面消毒劑對(duì)其組織進(jìn)行消毒；隨后用無(wú)菌水沖洗組織表面；消毒徹底后接種于平板中；根據(jù)不同的內(nèi)生菌種類選擇適宜條件進(jìn)行培養(yǎng)；根據(jù)條件按不同菌落進(jìn)行分離。

1.2.1 植物內(nèi)生細(xì)菌存在多樣性

內(nèi)生細(xì)菌種類具有多樣性，分離普遍采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。自20世紀(jì)中葉起，國(guó)外就已經(jīng)在多種植物中分離得到不同種屬的內(nèi)生細(xì)菌。我國(guó)在植物內(nèi)生菌領(lǐng)域研究雖然起步較晚，但也有研究者從番茄、棉花、富貴竹、辣椒、哈密瓜、馬尾松、煙草等不同植物中分離得到多種內(nèi)生細(xì)菌，包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、歐文氏菌屬(Erwinia)及短小桿菌屬(Cutrobacterium)等不同菌屬，其中芽孢桿菌屬的菌株在多種植物中均有發(fā)現(xiàn)[15]。研究人員統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生細(xì)菌在根部及種子中的含量相對(duì)高，在莖和葉中相對(duì)較少。

曾慶桂等[16]對(duì)珍貴藥用蕨類植物蛇足石杉(Huperzia serrate)內(nèi)生菌進(jìn)行了研究，篩選得到一株能夠拮抗小麥赤霉等植物病害真菌的內(nèi)生細(xì)菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化以及16S rDNA分子鑒定，初步鑒定為屬伯克霍爾德屬，與常用的生防菌洋蔥伯克霍爾德菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，將其命名為Burkholderiasp.H-6。方曉梅等[17]采用不同培養(yǎng)基從蜘蛛抱蛋屬植物中分離得到156株內(nèi)生細(xì)菌，結(jié)合16S rRNA進(jìn)行進(jìn)化樹分析顯示分屬于3門10目22科29屬，且23.7%的細(xì)菌具有抑菌活性。

1.2.2 植物內(nèi)生真菌存在多樣性

內(nèi)生真菌種類具有多樣性，分離多采用馬鈴薯固體培養(yǎng)基。大多數(shù)植物內(nèi)生真菌屬于子囊菌(Ascomycetes)、盤菌綱(Discomyetes)和腔菌綱(Loculoascomyete)的部分屬種以及一些近源菌。目前已報(bào)道的藥用植物內(nèi)生真菌主要包括鐮刀菌屬、交鏈菌屬、青霉屬、根霉屬、芽枝霉屬、毛殼菌屬等，其種類十分豐富。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，已在80多個(gè)屬的幾百種禾本科植物中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生真菌[18]。

植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生酚、萜類、黃酮類等代謝產(chǎn)物，表現(xiàn)為抗腫瘤、抗氧化等不同生物活性。Min Q等[19]從銀杏中分離出的兩種內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生酚類和黃酮類化合物，通過形態(tài)學(xué)分析判斷這兩株真菌都屬于曲霉屬，進(jìn)一步采用分子手段對(duì)ITS1-5.8SITS2區(qū)域的分析鑒定了這兩株菌分別為Aspergillusnidulans和Aspergillusoryzae。華梅等[7]采用組織塊分離法從白木香(Aquilariasinensis(Lour.) Gilg.)莖稈及葉片中分離獲得對(duì)常見致病細(xì)菌具有明顯抑制活性的10株內(nèi)生真菌，其中A. rasikravindrii，Diaporthesp.,P. amygdali,Phomopsissp.,P. macrospinosa這5株是首次從該物種中分離得到。將傳統(tǒng)的微生物鑒定方法與分子生物學(xué)手段相結(jié)合，能夠大大提高微生物鑒定的可靠性，部分未知的新種也能夠被成功鑒定，為生物資源的多樣性補(bǔ)充新的種類。

1.2.3 植物內(nèi)生放線菌存在多樣性

內(nèi)生放線菌種類具有多樣性，分離多采用丙酸鈉、琥珀酸鈉等培養(yǎng)基。植物內(nèi)生放線菌中研究較多的是非弗蘭克氏菌屬的內(nèi)生固氮放線菌，其余絕大多數(shù)為鏈霉菌屬(Streptomyces)，其次是小雙胞菌屬(Microbispora)、小單孢菌屬(Micromonospora)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、鏈孢囊菌屬(Streptosporangium)。Uvidello F.Casitillo等[20]從巴塔哥尼亞南部的假山毛櫸和其他植物中分離出的內(nèi)生放線菌經(jīng)16S rRNA序列分析鑒定，發(fā)現(xiàn)這些放線菌與GenBank中報(bào)道的其他放線菌具有明顯差異，這證明了植物體內(nèi)存在大量的不同的內(nèi)生放線菌。

2 植物內(nèi)生菌活性代謝產(chǎn)物及其功能

2.1 內(nèi)生菌活性代謝產(chǎn)物種類

植物內(nèi)生菌活性代謝產(chǎn)物種類豐富，主要有萜類、生物堿、皂苷類、芳香類、多肽類等，其中很多代謝產(chǎn)物對(duì)人類疾病有很好的療效，另外內(nèi)生菌在植物資源保護(hù)的開發(fā)與應(yīng)用也具有重要作用，尤其有助于蘭科等珍稀瀕危物種的保護(hù)與開發(fā)利用。

表1 文獻(xiàn)已報(bào)道的內(nèi)生菌部分活性代謝產(chǎn)物

2.2 內(nèi)生菌活性代謝產(chǎn)物的應(yīng)用

內(nèi)生菌活性代謝產(chǎn)物具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗蟲等活性，在醫(yī)藥、農(nóng)藥、育種等領(lǐng)域有巨大的實(shí)用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

2.2.1 抗腫瘤類活性物質(zhì)

藥用植物內(nèi)生菌的活性代謝產(chǎn)物種類繁多，具有抗腫瘤作用主要包含萜類化合物(紫杉醇、紫杉烷等)、生物堿類化合物(長(zhǎng)春新堿、細(xì)胞松弛素等)、苯丙素類化合物、黃酮類化合物等多種活性物質(zhì)。紫杉醇屬于萜類化合物，以極低含量存在于不同紫杉醇屬植物樹皮和樹葉中，作為天然抗癌藥物之一，對(duì)卵巢癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、直腸癌等均有療效。方美娟等[21]通過X線單晶衍射、薄層色譜掃描(TLC)和核磁共振等方法確認(rèn)南方紅豆杉、榧樹和杉木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物中含有BFA活性成分，并具有良好的抗腫瘤效果。李俊峰等[22]采用乙酸乙酯提取檢測(cè)鐵皮石斛內(nèi)生菌TG2代謝產(chǎn)物，經(jīng)MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其代謝產(chǎn)物對(duì)腫瘤具有良好抑制效果。

長(zhǎng)春堿(Vinblastine)為生物堿，最初從夾竹桃科植物長(zhǎng)春花中提取，對(duì)治療白血病有明顯作用。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)從長(zhǎng)春花組織中分離出的內(nèi)生菌也能產(chǎn)生長(zhǎng)春堿及其衍生物。張玲琪等[23]通過薄層色譜掃描法(TLC)和高效液相色譜法(HPLC)證明長(zhǎng)春花的內(nèi)生真菌尖鐮孢(Fusariumoxysporum)可以產(chǎn)生該類物質(zhì)，大大減少了使用局限性。直接從植物種提取活性物質(zhì)，不僅量少且成本高，若能直接從內(nèi)生菌中提取與宿主具有相似活性的物質(zhì)，能夠大大提高實(shí)用價(jià)值減少研發(fā)成本。

2.2.2 抗菌類活性物質(zhì)

植物內(nèi)生菌的活性代謝產(chǎn)物功能多樣化，對(duì)人類感染的細(xì)菌和真菌具有拮抗作用，從天然產(chǎn)物中獲得抗菌物質(zhì)一直以來(lái)都是研究熱點(diǎn)。早期由于技術(shù)局限，大多數(shù)時(shí)候只能通過傳統(tǒng)方法分離得到一些代謝產(chǎn)物，進(jìn)行簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)分析及理化性質(zhì)檢測(cè)。目前已能夠采用先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)內(nèi)生菌產(chǎn)生的活性物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，為更深入的揭示物質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能分析提供基礎(chǔ)。王偉等[24]從核桃的根、莖、葉、果中分離出的內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生多種具有拮抗活性和化感作用的次生代謝產(chǎn)物，可以作為上述活性物質(zhì)的篩選材料。另外，一些新的抗菌素也已從植物內(nèi)生菌中篩選分離出，如抗菌素Fistupyrone、三萜糖苷類抗菌素等。

2.2.3 抗氧化類物質(zhì)

抗氧化作用也是部分植物內(nèi)生菌的重要生物活性之一，如杜仲內(nèi)生真菌Chaetomellasp.產(chǎn)生的黃酮類物質(zhì)，植物類彎胞屬內(nèi)生真菌產(chǎn)生的苯并吡喃以及九里香正青霉屬內(nèi)生真菌的生物堿類物質(zhì)Spiroquinazoline alkaloid等都具有明顯的抗氧化的作用[25]。

2.2.4 抗病毒類活性物質(zhì)

樊兵，吳云峰[26～27]等從獨(dú)活、紅藻、天竺葵等植物中分離出的部分內(nèi)生菌對(duì)煙草花葉病毒具有較好的抑制作用。由于病毒是農(nóng)作物、經(jīng)濟(jì)作物的主要病害，用化學(xué)藥物噴施防治會(huì)給生態(tài)環(huán)境造成較大危害，科研人員已發(fā)現(xiàn)部分內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物具有抗病毒活性，所以開發(fā)更多的微生物代謝產(chǎn)物來(lái)防治植物病毒害是一種有效途徑。

2.2.5 促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育

植株感染內(nèi)生菌的影響可以在其生長(zhǎng)發(fā)育方面表現(xiàn)出來(lái)，內(nèi)生菌對(duì)植物的幼苗生長(zhǎng)、種子萌發(fā)具有較好的促進(jìn)作用[28～29]。主要在種子萌發(fā)、分蘗生長(zhǎng)、幼苗存活、植株的高重和生長(zhǎng)勢(shì)、生物累積等多方面出現(xiàn)差異性[30]。植物內(nèi)生菌對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響主要通過以下四方面作用：

①產(chǎn)生植物生長(zhǎng)素、赤霉素以及細(xì)胞分裂素等代謝產(chǎn)物促進(jìn)植物生長(zhǎng)。

②從周圍環(huán)境中吸收或真菌菌絲消化釋放C、N、P等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)滿足植物生長(zhǎng)需要，直接促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。

③通過與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)、空間，或直接產(chǎn)生一些拮抗物質(zhì)抑制病原菌生長(zhǎng)，間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)[31]。如膠膜菌屬、假單胞菌屬、蠟核菌屬等都能產(chǎn)生吲哚乙酸或赤霉素，還有部分內(nèi)生菌不僅能產(chǎn)生吲哚乙酸，而且還能產(chǎn)生細(xì)胞分裂素(如草生歐文氏菌)，這些物質(zhì)都能有效促進(jìn)植物的生長(zhǎng)[32]。

④通過改變根部周圍的環(huán)境來(lái)緩解非生物壓力，如分泌胞外多糖來(lái)改變土壤結(jié)構(gòu)，改變生長(zhǎng)環(huán)境的pH值 從而增加植物根部對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，促進(jìn)植物生長(zhǎng)[33]。史應(yīng)武等[34]發(fā)現(xiàn)從甜菜根部分離的1株內(nèi)生菌能顯著增加甜菜鮮重、葉綠素含量及含糖率，有明顯的促生、增糖作用。

2.2.6 固氮作用

Chen等[35]用來(lái)自棉花的內(nèi)生細(xì)菌回接棉花，可以減輕人工接種感染的棉花枯萎癥狀。科研人員很早就提出了豆科植物-根瘤菌共生固氮體系，而內(nèi)生菌與非豆科植物的固氮作用是在Dobereiner等[36]于1975年從甘蔗分離出內(nèi)生固氮螺菌、并提出聯(lián)合固氮概念后才開始引起關(guān)注。

2.2.7 增強(qiáng)植物抗逆性

植物感染內(nèi)生菌與否，對(duì)植物的抗逆性表現(xiàn)不同，內(nèi)生菌可以增強(qiáng)植株對(duì)逆境的適應(yīng)性。例如：

①在非生物脅迫方面，感染內(nèi)生菌的植物對(duì)環(huán)境脅迫如干旱、鹽堿具有更強(qiáng)的抗性。鹽生植物濱麥[Leymusmollis(Trin.) Hara]能夠與黃色鐮刀菌共生，而鐮刀菌能夠協(xié)助宿主抵抗高鹽環(huán)境，使濱麥具有耐高鹽環(huán)境的特性[37～38]。Cui JL等[39]篩選出的內(nèi)生菌在低海拔環(huán)境下能夠保證紅景天正常發(fā)育并提高其天苷和酪醇的產(chǎn)量。

②在生物脅迫方面，感染內(nèi)生菌的植株可阻止其他昆蟲和食草動(dòng)物的采食、抗病毒蟲害?？蒲腥藛T從植物中分離出的內(nèi)生菌制成菌劑，注入同種植物或不同種類植物中，能夠很好的抵抗病蟲害。

2.2.8 作為生防因子應(yīng)用

植物內(nèi)生菌可以作為生防因子，由此思路可以開發(fā)出一些植物生防菌劑。

3 結(jié)論及展望

近年來(lái)，醫(yī)學(xué)、中藥學(xué)、生態(tài)學(xué)、微生物學(xué)、植物病理學(xué)的專家學(xué)者對(duì)植物內(nèi)生菌的相關(guān)研究已越來(lái)越關(guān)注。其活性代謝產(chǎn)物種類繁多、結(jié)構(gòu)新穎、作用方式多樣，是一條尋找更多新的生物活性物質(zhì)的有效途徑；同時(shí)也為天然藥物的開發(fā)和應(yīng)用提供了便利。由于藥用植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物具有不同的藥用功能，可以考慮結(jié)合基因工程、蛋白質(zhì)工程、生物化學(xué)與分子生物學(xué)等技術(shù)手段培養(yǎng)可以產(chǎn)特異性活性代謝產(chǎn)物的菌株，大量生產(chǎn)并制備具有治療效果的微生物代謝產(chǎn)物，這樣可以極大的提高內(nèi)生菌的利用利率，降低生產(chǎn)成本，但是如何找到適宜的技術(shù)體系是個(gè)難題。

由于植物種類多種多樣，存在于其組織內(nèi)的內(nèi)生菌自然也極其豐富，這是一個(gè)珍貴和極具開發(fā)潛力的微生物資源寶庫(kù)。但植物內(nèi)生菌在植物體內(nèi)分布存在種屬特異性、組織偏好性、地區(qū)差異性等多方面因素，因此對(duì)這一天然微生物資源的開發(fā)和利用尚有很多不足之處，目前已開發(fā)的資源還較少，合理開發(fā)利用植物內(nèi)生菌資源，尋找新的活性物質(zhì)，在今后的研究中將更受關(guān)注。當(dāng)然，在植物內(nèi)生菌資源的開發(fā)利用方面還有很大的提升空間，如何精準(zhǔn)、簡(jiǎn)單、高效的分離內(nèi)生菌是一個(gè)亟待解決的問題。一般情況下，植物內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物含量較少且分離純化困難，有時(shí)難以完成結(jié)果鑒定和活性測(cè)定的所有流程，因此，尋找可靠、有效的方法提高獲得內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物含量是目前迫切需要解決的問題之一。

此外，由于大多數(shù)植物都需要與內(nèi)生菌共生，但在共生過程中，內(nèi)生菌究竟發(fā)揮什么作用、以何種方式發(fā)揮作用，一直是困擾學(xué)術(shù)界的大問題，這就是宿主-微生物之間的互作關(guān)系。更好的了解宿主-微生物間的共生機(jī)制，深入研究植物內(nèi)生菌與宿主之間的互作關(guān)系必然引起越來(lái)越多科研人員的興趣，從而成為今后的熱點(diǎn)問題。