老年膽囊癌患者手術(shù)前后血清VEGF-C及其受體fms樣酪氨酸激酶4水平變化及其臨床意義

王紹勇，鄧小凡

(1.成都市第十一人民醫(yī)院外一科，四川 成都 610081；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院外六科，四川 成都 610072)

膽囊癌位居膽道惡性腫瘤首位[1]，癥狀缺乏特異性，早期診斷困難，出現(xiàn)明顯癥狀時(shí)，已屬晚期，生存率低，尤其老年患者基礎(chǔ)狀況差，預(yù)后更差[2]。手術(shù)是膽囊癌主要治療途徑，但即便膽囊原發(fā)灶浸潤(rùn)程度低，仍可能存在肝臟浸潤(rùn)或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，根治困難[3]。目前認(rèn)為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是其主要致死原因[4]，而淋巴管在惡性腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移中有重要作用，可為腫瘤生長(zhǎng)提供必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，增加生物異質(zhì)性，促成其浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移[5]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)系調(diào)節(jié)大部分腫瘤新生血管生成的關(guān)鍵因子，近期被證實(shí)在肺癌、肝癌淋巴轉(zhuǎn)移中有重要作用[6，7]。其中VEGF-C為誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮增殖及趨化的特異性因子，屬淋巴管有絲分裂素，其受體fms樣酪氨酸激酶4(fins like tyrosine kinase 4，F(xiàn)lt-4)特異性表達(dá)于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)癌細(xì)胞淋巴管生成，促成腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移[8]。但有關(guān)VEGF-C及其受體Flt-4在老年膽囊癌中的表達(dá)及作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)對(duì)老年膽囊癌患者手術(shù)前后VEGF-C、Flt-4水平進(jìn)行檢測(cè)，與膽囊腺瘤樣息肉進(jìn)行對(duì)照，并將膽囊癌VEGF-C、Flt-4水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系展開研究，旨在明確兩者在膽囊癌發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移中的作用，為膽囊癌臨床診治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料2014年1月至2018年4月成都市第十一人民醫(yī)院收治的72例老年膽囊癌患者(病例組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)為膽囊癌；②年齡≥60歲；③初發(fā)初治，接受腹腔鏡膽囊癌根治術(shù)，術(shù)前均未接受放化療或其他抗腫瘤治療；④臨床資料完善。選取同期收治的42例老年膽囊腺瘤樣息肉患者作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理證實(shí)為膽囊腺瘤樣息肉，接受腹腔鏡息肉切除術(shù)；②留存血樣標(biāo)本；③臨床資料完善。排除標(biāo)準(zhǔn)：①均排除慢性肝炎、肝硬化；②心腎肺器質(zhì)性功能障礙；③合并嚴(yán)重腦血管?。虎芎喜⑵渌麗盒阅[瘤；⑤繼發(fā)膽囊癌；⑥合并嚴(yán)重精神疾??；⑦預(yù)計(jì)生存期<3月；⑧臨床資料不全。病例組男31例，女41例；年齡60～79歲[(70.5±5.7)歲]；美國(guó)腫瘤聯(lián)合會(huì)(American Joint Committee on Cancer，AJCC)第7版TNM分期[9]：Ⅰ期12例，Ⅱ期27例，Ⅲ期28例，Ⅳ期4例；分化程度：低分化10例，中分化23例，高分化38例；病理類型：腺癌66例，鱗癌6例；腫瘤位置：升結(jié)腸14例，橫結(jié)腸18例，降結(jié)腸13例，乙狀結(jié)腸27例。對(duì)照組男18例，女24例；年齡61～78歲[(70.6±5.4)歲]。

1.2 方法兩組均采集術(shù)前1 d、術(shù)后1 周空腹外周血標(biāo)本5 ml，靜置2 h后離心20 min，1000 r/s，取上清液低溫(-80 ℃)保存，采用ELISA法測(cè)定VEGF-C、Flt4水平，VEGF-C、Flt4 ELISA法試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司，儀器為美國(guó)Bio-Rad公司Mlcroplate reader 800型酶標(biāo)儀。待測(cè)樣本室溫融化，按說(shuō)明書稀釋標(biāo)準(zhǔn)品、血清，加入樣本孔，封板，搖床孵育2 h，洗板4次，加入耦合物，封閉，搖床孵育2 h，洗板，混合顯色劑，加入孔板，避光孵育2 h，終止液終止反應(yīng)，450 nm酶標(biāo)儀讀取光密度值(optical density，OD)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，軟件計(jì)算樣本濃度。

1.3 觀察指標(biāo)收集老年膽囊癌患者臨床資料，包括性別、年齡、腫瘤直徑、臨床分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝臟侵犯等，分析術(shù)前1 d VEGF-C、Flt4水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；受試者工作特征曲線(ROC)評(píng)價(jià)血清VEGF-C、Flt4預(yù)測(cè)膽囊癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的價(jià)值；相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組VEGF-C、Flt4水平比較病例組術(shù)前1 d VEGF-C、Flt4均高于對(duì)照組(P<0.05)，術(shù)后1周，兩組VEGF-C、Flt4均降低，對(duì)照組低于病例組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組手術(shù)前后VEGF-C、Flt4水平比較 (pg/ml)

2.2 不同人口學(xué)資料膽囊癌患者血清VEGF-C、Flt4水平比較不同性別、不同年齡膽囊癌患者VEGF-C、Flt4水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 不同病理資料膽囊癌患者血清VEGF-C、Flt4水平比較不同腫瘤直徑、病理類型膽囊癌患者VEGF-C、Flt4水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、分化程度為中低分化、伴肝臟侵犯、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的老年膽囊癌患者VEGF-C、Flt4高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、分化程度為高分化、不伴肝臟侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膽囊癌患者(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表2 不同人口學(xué)資料老年膽囊癌患者血清VEGF-C、Flt4水平比較 (pg/ml)

表3 不同病理資料膽囊癌患者血清VEGF-C、Flt4水平比較 (pg/ml)

2.4 血清VEGF-C、Flt4預(yù)測(cè)膽囊癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的價(jià)值分析ROC曲線分析顯示：VEGF-C預(yù)測(cè)膽囊癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移曲線下面積為0.827(95%CI：0.734～0.919)，當(dāng)臨界值為388.83 pg/ml時(shí)VEGF-C預(yù)測(cè)膽囊癌轉(zhuǎn)移敏感度及特異性最高，分別為85.70%、73.30%；Flt4預(yù)測(cè)膽囊癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移曲線下面積為0.744(95%CI：0.631～0.858)，當(dāng)臨界值為513.541 pg/ml時(shí)Flt4預(yù)測(cè)膽囊癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移敏感度及特異性最高，分別為82.10%、57.80%，圖1。

2.5 老年膽囊癌患者血清VEGF-C與Flt4表達(dá)相關(guān)性分析老年膽囊癌患者血清VEGF-C與Flt4表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.491，P<0.001)，圖2。

圖1 血清VEGF-C、Flt4預(yù)測(cè)膽囊癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移ROC曲線

圖2 老年膽囊癌患者血清VEGF-C與Flt4表達(dá)相關(guān)性分析

3 討論

膽囊癌約占膽道腫瘤的80%～95%，起病隱匿，惡性程度高，預(yù)后差，進(jìn)展期或中晚期膽囊癌5年生存率低于5%，中位生存期低于6個(gè)月[10]。實(shí)體瘤生長(zhǎng)、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移均與新生血管生成密切相關(guān)，癌細(xì)胞通過(guò)淋巴管及血管擴(kuò)散至其他器官系惡性腫瘤典型生物學(xué)特點(diǎn)，同時(shí)也是影響患者預(yù)后的關(guān)鍵，故必須重視淋巴管生成在癌癥進(jìn)展中的作用。VEGF-C屬VEGF家族分泌性二聚體糖蛋白，主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞及纖維母細(xì)胞內(nèi)，屬內(nèi)皮細(xì)胞特異性絲裂原及血管通透因子，具有刺激淋巴管及血管生成雙向作用，可與其受體Flt4特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子生成，誘導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移[11]。目前已證實(shí)肺癌患者癌組織VEGF-C呈明顯高表達(dá)。但對(duì)老年膽囊癌患者血清VEGF-C的作用尚少見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，老年膽囊癌患者血清VEGF-C表達(dá)水平明顯高于良性膽囊腺瘤樣息肉患者，推測(cè)VEGF-C可能存在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)作用，且與膽囊癌惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。分析機(jī)制為：VEGF-C作用為旁分泌形式，可與受體Flt4特異性結(jié)合，引起Flt4磷酸化，活化細(xì)胞骨架蛋白，促成淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞遷移；同時(shí)激活RAS/MAPK或JNK信號(hào)通路，誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞激動(dòng)蛋白重組，刺激癌細(xì)胞增殖及DNA有絲分裂，促成癌組織淋巴管生成及遷移。在進(jìn)行手術(shù)治療后患者VEGF-C均明顯降低，這與手術(shù)治療后膽囊癌患者腫瘤負(fù)荷降低，癌細(xì)胞淋巴管及新生血管血流阻滯后VEGF-C表達(dá)降低有關(guān)。

Flt4屬絡(luò)氨酸激酶，在胚胎發(fā)育初期存在于所有內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，后期主要分布于小靜脈及淋巴管，為成熟淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn)，癌組織周邊新生淋巴管、腫瘤轉(zhuǎn)移組織淋巴結(jié)內(nèi)淋巴內(nèi)皮細(xì)胞均可見(jiàn)Flt4高表達(dá)。在同一組織內(nèi)，VEGF-C與Flt4親和力較強(qiáng)，兩者形成淋巴管生成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，協(xié)同調(diào)控癌細(xì)胞間質(zhì)血管網(wǎng)及淋巴管生成。本研究發(fā)現(xiàn)，老年膽囊癌患者血清Flt4表達(dá)水平較良性膽囊腺瘤樣息肉患者高，與VEGF-C表達(dá)趨勢(shì)一致，兩者表達(dá)呈正相關(guān)，在手術(shù)治療后降低，推測(cè)VEGF-C上調(diào)Flt4表達(dá)，兩者存在正性調(diào)控協(xié)同作用，考慮膽囊癌患者癌細(xì)胞自分泌輔以旁分泌途徑產(chǎn)生VEGF-C后作用于細(xì)胞膜Flt4受體，導(dǎo)致Flt4表達(dá)上調(diào)，刺激癌細(xì)胞浸潤(rùn)、遷移；而在根治性切除術(shù)后腫瘤血管活性降低，VEGF-C表達(dá)減少，所刺激生成的Flt4表達(dá)降低。王若帆等[12]認(rèn)為，VEGF-C及Flt4表達(dá)與腫瘤直徑無(wú)關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，不同直徑膽囊癌患者VEGF-C、Flt4表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與上述結(jié)論相同，故認(rèn)為腫瘤直徑與膽囊癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。對(duì)VEGF-C、Flt4表達(dá)與腫瘤分化程度的關(guān)系目前尚存在一定的爭(zhēng)論。陳晨等[13]認(rèn)為，分化程度較低的癌組織VEGF-C表達(dá)水平較高。也有觀點(diǎn)認(rèn)為，腫瘤分化程度與VEGF-C表達(dá)無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn)，年齡、性別與膽囊癌患者血清VEGF-C及Flt4表達(dá)無(wú)關(guān)，而中低分化程度的膽囊癌患者血清VEGF-C及Flt4表達(dá)水平高于高分化患者，且VEGF-C、Flt4表達(dá)與膽囊癌臨床分期有關(guān)，提示兩者均與膽囊癌惡性進(jìn)展有關(guān)，一般分化程度較低的膽囊癌患者細(xì)胞惡性生物學(xué)行為更典型，細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移速度快，新生血管生成更多，故VEGF-C、Flt4表達(dá)水平較高。

本研究還發(fā)現(xiàn)，VEGF-C、Flt4表達(dá)與膽囊癌肝臟侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，分析機(jī)制可能為：VEGF-C通過(guò)與受體Flt4作用可誘導(dǎo)膽囊癌淋巴管生成；血清VEGF-C受體Flt4表達(dá)上調(diào)可進(jìn)一步提升淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)VEGF-C的反應(yīng)性，誘導(dǎo)淋巴管增生；而增生淋巴管增多為癌細(xì)胞淋巴管轉(zhuǎn)移及侵犯奠定了基礎(chǔ)，促進(jìn)膽囊癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝臟侵犯。此外，本研究進(jìn)行ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)VEGF-C、Flt4預(yù)測(cè)老年膽囊癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移價(jià)值均較高，當(dāng)VEGF-C臨界值為388.83 pg/ml時(shí)VEGF-C預(yù)測(cè)膽囊癌轉(zhuǎn)移敏感度及特異性別為85.70%、73.30%；Flt4臨界值為513.541 pg/ml預(yù)測(cè)膽囊癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移敏感度及特異性分別為82.10%、57.80%，兩組預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移曲線下面積分別為0.827、0.744，VEGF-C整體價(jià)值略優(yōu)于Flt4，為本研究的創(chuàng)新點(diǎn)，提示兩者均有望作為推測(cè)老年膽囊癌是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的依據(jù)。