翼狀胬肉患者眼表微生物菌群分析

惠 娜，秦 莉，黎 黎

0引言

翼狀胬肉是一種眼部常見的慢性炎癥性增殖性疾病，瞼裂部異常增生肥厚的球結(jié)膜及其下纖維組織跨越角膜緣長入角膜形成其典型翼狀形態(tài)[1]。近年來，對翼狀胬肉發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量研究和探索，例如角膜緣干細(xì)胞屏障受損失去屏障作用、紫外線照射、病毒感染、遺傳因素或基因突變、細(xì)胞因子、生長因子、金屬蛋白酶增加、地理環(huán)境等因素均有影響[2-4]，以及對于翼狀胬肉致病基因的鑒定研究[5]，但尚無定論。有研究表明，免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。而眼表微生物菌群與外部環(huán)境交互作用，參與機(jī)體防御等免疫反應(yīng)環(huán)節(jié)，維持眼表微生物的穩(wěn)定對于眼部意義重大。目前微生物組的研究多集中于腸道、口腔[6-7]，而眼表微生物菌群組成的變化是否與翼狀胬肉相關(guān)尚不清楚，未來對翼狀胬肉治療的研究方向可能集中在基因遺傳途徑上[8]。因此，本研究通過16S rDNA基因測序翼狀胬肉眼及對側(cè)正常眼眼表微生物菌群的多樣性、相對豐度等進(jìn)行比較，從而探討翼狀胬肉患者眼表微生物組成的改變，為下一步研究翼狀胬肉的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為翼狀胬肉的預(yù)防和治療提供新的思路。

1對象和方法

1.1對象研究對象為2018-09/2019-01在我院就診的50例翼狀胬肉患者，最終根據(jù)獲取DNA濃度，納入翼狀胬肉組(A組)為26例26眼，對照組(B組)為胬肉患者的對側(cè)正常眼9例9眼。兩組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：單眼發(fā)病；原發(fā)性翼狀胬肉。排除標(biāo)準(zhǔn)：有其它眼部疾病、過敏性疾病及全身性疾病，近期配戴過角膜接觸鏡，近期做過眼表理療及眼部手術(shù)，近期使用過激素類藥物。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，通過本院倫理委員會認(rèn)證，征得患者同意并簽字，擬行嚴(yán)格無菌眼表取材。

1.2方法

1.2.1樣品采集與保存受試者雙眼滴鹽酸丙美卡因滴眼液，1～3min后囑受試者雙眼向上看，使用無菌干棉拭子，輕微壓力涂擦受試者眼球下方的球結(jié)膜表面。囑受試者勿眨眼，勿碰觸眼部皮膚等其他部位，嚴(yán)格無菌操作。采用同樣的方法對受試者對側(cè)正常眼進(jìn)行樣本采集。結(jié)膜樣本拭子，保存于1.5mL無菌管中放入冰盒送入實(shí)驗(yàn)室，-80℃冰箱凍存，1wk內(nèi)提取(16Sr)DNA。

1.2.2 DNA提取與PCR擴(kuò)增樣本被接收后,將棉拭子前端無菌處理剪下，轉(zhuǎn)移至離心管中，裂解，冷卻，加入1mL酚/氯仿/異戊醇離心12000r/min，10min,25℃。取上清，加入-20℃預(yù)冷的異丙醇，10% 3mL醋酸鈉，-20℃過夜沉淀。重復(fù)離心3次，晾干后溶于適量緩沖液，提取完成，使用10g/L瓊脂糖凝膠檢測DNA提取質(zhì)量。用V3-341F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和V4-806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)通用區(qū)引物對16SV3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。取30ng DNA樣品及融合引物配置PCR反應(yīng)體系。以基因組DNA為模板，進(jìn)行融合引物PCR，使用Agencourt AMPure XP磁珠進(jìn)行純化并溶于Elution Buffer，建庫完成。使用Agilent 2100 Bioanalyzer軟件檢測文庫的片段范圍及濃度。檢測合格的文庫進(jìn)行測序。

1.2.3測序及數(shù)據(jù)處理

1.2.3.1高通量測序使用IIIumina的Miseq PE301+8+8+301平臺進(jìn)行雙端測序。

1.2.3.2數(shù)據(jù)處理下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾，濾除低質(zhì)量的reads，剩余的Clean data用于后期分析；將reads拼接成Tags；將Tags聚成OTU，對OTU進(jìn)行物種注釋；基于OTU和物種注釋結(jié)果進(jìn)行樣品物種復(fù)雜度分析以及組間物種差異分析。群落結(jié)構(gòu)層面：多樣本物種分布比較，群落相似度比較，群落相似度PCoA分析，組間進(jìn)化的差異顯著性(Un)Weighted Unifrac分析，分析因子之間的關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖1維恩圖。

圖2基于豐度的PLS-DA分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用Lefse軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，找出各組間差異的微生物種類，兩樣本間的差異分析及多樣性比較采用R軟件的秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 OTU聚類分析在97%相似性下對序列進(jìn)行OTU聚類分析，共得到1837個OTUs，翼狀胬肉組共含有1381個OTUs，對照組共得到1207個OTUs，兩組共有的OTU個數(shù)為751個(圖1)。各組樣品豐富度和均勻度良好,而翼狀胬肉組比對照組擁有較多的特有OTU個數(shù)。

2.2基于OTU豐度的PLS-DA分析PLS-DA分析是一種將主成分分析和多元回歸的功能相結(jié)合，達(dá)到循環(huán)PCA的各個成分以使其之間的間隔達(dá)到最大化，從而加大各組觀察結(jié)果之間的間隔的目的。本研究的PLS-DA分析顯示翼狀胬肉組與對照組分成了兩個群落，顯示了兩組OTU豐度上有差異(圖2)。

2.3物種注釋分析兩組樣本共鑒定出了172種細(xì)菌，這些細(xì)菌分為34個門369屬。兩組眼表微生物菌群結(jié)構(gòu)在門水平上的比較：兩組樣本的前四位優(yōu)勢菌門相同，豐度由高至低依次為：放線菌門、厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門。四種優(yōu)勢菌門共占翼狀胬肉組的97%，占對照組中的92%。在翼狀胬肉組，放線菌門豐度明顯高于正常對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.87，圖3)。

在屬水平，翼狀胬肉組共發(fā)現(xiàn)337個菌屬，明顯高于對照組的275個菌屬。同樣兩組前三位優(yōu)勢菌屬相同，豐度由高至低依次為：棒狀桿菌屬、未分類菌屬、葡萄球菌屬，共占翼狀胬肉組的53%，占對照組的49%。在翼狀胬肉組，棒狀桿菌的豐度明顯高于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.57，圖4)。

在種水平，未分類菌種、葡萄球菌種及鏈球菌種為兩組樣本的共同優(yōu)勢菌種，其中，未分類菌種在兩組中豐度均最高，且在兩組中比例基本相同。值得關(guān)注的是，棒狀桿菌在翼狀胬肉組的豐度仍明顯高于對照組，表皮葡萄球菌種、放線菌種及副球菌種在翼狀胬肉組豐度明顯低于正常對照組(圖5)。

圖3樣品門分類水平中物種柱狀圖。

圖4樣品屬分類水平中物種柱狀圖。

圖5樣品種分類水平中物種柱狀圖。

2.4 Alpha多樣性分析通過單樣品的多樣性分析(Alpha多樣性)可以反映微生物群落的豐度和多樣性。根據(jù)obseerved species指數(shù)、chao指數(shù)、ace指數(shù)分析，對照組的多樣性高于翼狀胬肉組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖6)。兩組物種多樣性存在差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖6)。本次樣品文庫的平均覆蓋率(coverage指數(shù))為99.93%,稀釋曲線平緩已達(dá)到平臺期，反映測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品的所有物種，能代表樣品的真實(shí)情況(圖7)。

2.5樣品組間菌群構(gòu)成差異分析我們通過對兩組樣本進(jìn)行l(wèi)efse分析顯示，兩組樣品共有15種差異菌被發(fā)現(xiàn)，它們分別屬于不同分類水平的菌，在翼狀胬肉組特有的物種為：紫單胞菌科、圖利茨菌目；對照組特有的物種為：紅細(xì)菌目、副球菌屬、奈瑟球菌屬、乏養(yǎng)菌屬、卟啉單胞菌屬、反硝化細(xì)菌熱胞菌屬、黃單胞菌屬、郝檸檬氏菌屬、勞特羅普氏菌屬。這些差異物種在兩組的相對豐度及數(shù)量均較低(圖8)。

3討論

微生物的多樣性及結(jié)構(gòu)研究是進(jìn)行復(fù)雜微生態(tài)系分析的基礎(chǔ),通過研究翼狀胬肉患者眼表及正常眼表微生物菌群的豐度與結(jié)構(gòu),能夠揭示翼狀胬肉眼表與正常眼表微生物群落之間的關(guān)系,從而為預(yù)防和治療翼狀胬肉提供合理的理論依據(jù)[9]。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注到在機(jī)體定植的微生物菌群，已參與到宿主的防御、免疫等多個環(huán)節(jié)，微生物菌群與機(jī)體的交互作用，對機(jī)體疾病的發(fā)生發(fā)展有深遠(yuǎn)影響。例如腸道菌群與糖尿病、肥胖、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)直腸癌、甲狀腺功能亢進(jìn)，甚至焦慮、抑郁癥，都有較強(qiáng)關(guān)聯(lián)[6，10]。但眼表微生物菌群以及其與眼部疾病的關(guān)系研究報(bào)道甚少。以往傳統(tǒng)微生物細(xì)菌培養(yǎng)法顯示：構(gòu)成人眼表的微生物群落以革蘭氏陽性菌為主，其中主要以葡萄球菌屬為主，其次是類白喉菌(包括棒狀桿菌)、鏈球菌、丙酸桿菌、微球菌等，其他還偶見芽孢桿菌、假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌、大腸埃希菌、產(chǎn)堿桿菌、不動桿菌、奈瑟菌和莫拉菌等[11-12]，國外研究還分離出少量的考克菌、羅氏菌、氣球菌、腸球菌、流感嗜血桿菌等[13-15]。但傳統(tǒng)微生物檢測，大多情況是純培養(yǎng)，不可避免地會造成菌株的富集或衰減，人為地改變了原始菌群的構(gòu)成，對研究結(jié)果造成了較大的偏差[16]。并且對于復(fù)雜環(huán)境的局限性，許多微生物無法培養(yǎng)得到，因此嚴(yán)重低估了微生物多樣性對宿主的影響。而且，僅從形態(tài)特征，理化特征、菌體某些化學(xué)成分，還不足以鑒定微生物，以及深刻認(rèn)識其親緣關(guān)系，也不能解釋臨床現(xiàn)象，故需要從基因水平全面識別微生物的特點(diǎn)。16S rRNA/DNA序列分析的優(yōu)勢在于：可檢測出罕見的細(xì)菌；可作為分枝桿菌的常規(guī)檢測手段；幫助人們發(fā)現(xiàn)新的菌種；檢測無法分離培養(yǎng)的細(xì)菌等。16S rRNA/DNA序列分析已經(jīng)被應(yīng)用于分析腸道[17]、口腔[18-19]、呼吸道[20]等多部位，針對眼部的研究相對較少，目前仍未得出公認(rèn)的眼表微生物菌群結(jié)果[21]，但根據(jù)針對結(jié)膜炎[22-24]、角膜炎[25]、干眼[26]等研究，均認(rèn)為該方法是分析眼部樣品科學(xué)可靠的方法。近年來，越來越多的微生物的16S rDNA序列被測定并收入國際基因數(shù)據(jù)庫中，用16S rDNA作目的序列進(jìn)行微生物菌群結(jié)構(gòu)分析更為快捷方便。

圖6組間Alpha多樣性盒形圖A：obseerved species指數(shù)；B：chao指數(shù)；C：ace指數(shù)；D：shannon指數(shù)；E：simpson指數(shù)；F：Good’s coverage。

圖7物種多樣性Alpha指數(shù)稀釋曲線圖。

圖8LDA SCORE。

本研究基于16S rDNA的PCR產(chǎn)物的基因鑒定法在兩組樣本中共發(fā)現(xiàn)了172種細(xì)菌，顯示眼表的細(xì)菌多樣性明顯高于其他技術(shù)[9，22]，在屬水平，豐度最高的是棒狀桿菌，此結(jié)果與我們其它實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果一致，說明了研究結(jié)果的可靠性。兩組均以革蘭氏陽性菌為主，這與傳統(tǒng)的微生物細(xì)菌培養(yǎng)的檢測結(jié)果相一致。本研究與美國BASCOM PALMER眼科研究所運(yùn)用二代測序技術(shù)基于16S rDNA PCR鑒定法對部分健康人群的眼表菌群的研究結(jié)果基本相似[22，27-28]，進(jìn)一步印證了眼表菌群主要由以凝固酶陰性葡萄球菌、棒狀桿菌、鏈球菌、丙酸桿菌等革蘭氏陽性菌為主的多種菌共同組成。同時(shí)，無法分類菌種在種水平上兩組中均占比例較高，說明新技術(shù)一方面證實(shí)了部分經(jīng)典培養(yǎng)法對眼部菌群研究的結(jié)論，另一方面對菌群分析得更加細(xì)致和準(zhǔn)確的同時(shí)也產(chǎn)生了新的問題。

根據(jù)多樣性研究結(jié)果顯示翼狀胬肉組眼表微生物菌群Alpha多樣性較正常對照組減少(P<0.01)。但考慮相對豐度及物種均勻度的影響后的shannon指數(shù)并未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。Beta多樣性顯示兩組菌群構(gòu)成區(qū)分不明顯。說明兩組的菌群組成相似度高，但翼狀胬肉組的微生物菌群物種的豐富度較正常對照組減少，有顯著差異性。在健康人體中，微生物群、宿主和外環(huán)境所構(gòu)成的生態(tài)系統(tǒng)在正常情況下是相互平衡的，平衡遭到破壞而引起疾病稱為微生態(tài)失衡[7]。而多樣性的減少可能導(dǎo)致眼表微生物菌群的微生態(tài)失衡，影響到機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)及眼表微生物菌群的穩(wěn)態(tài)。這是否與翼狀胬肉的發(fā)生有一定的相關(guān)性是值得研究的問題。

另外，值得關(guān)注的是，兩組樣品在屬水平及種水平上，棒狀桿菌的豐度在翼狀胬肉組均明顯高于對照組。棒狀桿菌屬革蘭氏陽性桿菌。除白喉棒狀桿菌外，其他棒狀桿菌為人類口腔、鼻腔、咽喉部、外耳道、眼結(jié)膜、外陰和皮膚等處的寄生菌，這類細(xì)菌一般無致病性，因此在臨床上棒狀桿菌一般被視為正常菌群[27，29]。但近年研究表明，該菌屬的多數(shù)菌種均可作為條件致病菌引起抵抗力低下的宿主發(fā)生各類感染[30]。由于以往檢測條件的限制，棒狀桿菌的檢出率遠(yuǎn)較實(shí)際低。而本研究結(jié)果中棒狀桿菌檢出的比例增加提示可能會增大了條件致病的可能性。

綜上所述，我們的研究結(jié)果顯示了翼狀胬肉組較對照組在眼表微生物菌群的數(shù)量和多樣性方面有差異。其中，引起我們關(guān)注的是棒狀桿菌的比例在翼狀胬肉組明顯增高，而這種結(jié)果是否會引起進(jìn)一步的免疫反應(yīng)，并與翼狀胬肉的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，這是我們進(jìn)一步研究的方向。