眼瞼黃色瘤巨噬細(xì)胞清道夫受體1單核苷酸多態(tài)性研究

李永蓉，王志敏，王 慧，楊穎秋，紀(jì)風(fēng)濤

0引言

眼瞼黃色瘤好發(fā)于中年女性上瞼內(nèi)側(cè)，發(fā)病機(jī)制不明確，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為其與脂質(zhì)代謝有關(guān)，但是臨床檢查經(jīng)常發(fā)現(xiàn)患者血脂正常。眼瞼黃色瘤是由含有大量脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞組成，其主要成分是膽固醇酯，也有炎性細(xì)胞沉積，患者常伴有家族性高膽固醇血癥、β-脂蛋白血癥。巨噬細(xì)胞清道夫受體(MSR)是一類結(jié)構(gòu)多樣化的糖蛋白受體，其中巨噬細(xì)胞清道夫受體1(MSR1)是一種吞噬變性低密度脂蛋白，形成泡沫細(xì)胞的主要受體[1]，是重要的抗動(dòng)脈粥樣硬化的受體。單核苷酸多態(tài)性(SNP)指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的脫氧核糖核酸(DNA)序列多態(tài)性，即指基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在兩種不同的核苷酸且其出現(xiàn)的頻率大于1%。本研究旨在通過(guò)檢測(cè)MSR1單核苷酸多態(tài)性探討眼瞼黃色瘤的相關(guān)發(fā)病機(jī)制。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象選取2017-01/2018-12在合肥市第二人民醫(yī)院眼科門診就診擬行肝素鈉局部注射治療的眼瞼黃色瘤患者20例作為試驗(yàn)組，其中女19例，男1例，年齡35～52歲，發(fā)病時(shí)間3mo～2a，均為緩慢長(zhǎng)大。排除合并其它眼部疾病，既往接受其它方法治療者。另選取健康志愿者20例為對(duì)照組，其中女19例，男1例，年齡34～50歲。兩組受檢者均為漢族，無(wú)遺傳病史，且性別構(gòu)成比、年齡等一般資料差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)審批同意。所有受檢者均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法所有受檢者均空腹抽取外周靜脈血，離心后取血清置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，試?yàn)組患者同時(shí)進(jìn)行血常規(guī)、血糖、血脂、α-脂蛋白和頸動(dòng)脈彩超檢查。本研究采用一代測(cè)序(Sanger測(cè)序)方法進(jìn)行測(cè)序，檢測(cè)DNA樣本中單位SNP類型，檢測(cè)過(guò)程由北京六合華大基因科技公司武漢分公司執(zhí)行。具體步驟：(1)DNA提取：采用GK1041血液基因組DNA提取試劑盒(上海捷瑞生物工程公司)提取人真核細(xì)胞基因組DNA。(2)PCR擴(kuò)增：采用Prime 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，對(duì)MSR1基因的5條外顯子區(qū)域(S1、S2、S3、S4、S5)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。MRS1基因引物序列見表1。(3)測(cè)序反應(yīng)：DNA體外合成得到包含所有長(zhǎng)度的末端標(biāo)記片段的混合物。(4)測(cè)序示蹤：毛細(xì)管電泳過(guò)程中采用激光檢測(cè)各單鏈DNA走出凝膠的時(shí)間和熒光類型，通過(guò)熒光信號(hào)接收器和計(jì)算機(jī)信號(hào)分析系統(tǒng)自動(dòng)測(cè)序。

2結(jié)果

兩組受檢者M(jìn)SR1單核苷酸多態(tài)性無(wú)顯著差異，但檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)1例治療后又復(fù)發(fā)的患者第2條外顯子區(qū)域S2-SNP1位點(diǎn)發(fā)生純合突變，患者血脂正常，雙側(cè)頸動(dòng)脈硬化，右側(cè)頸外動(dòng)脈斑塊形成，3例患者第5條外顯子區(qū)域S5-SNP2位點(diǎn)、S5-SNP4位點(diǎn)發(fā)生純合突變，均伴有甘油三酯或總膽固醇增高，頸動(dòng)脈輕度硬化，見表2。此外，本研究納入的眼瞼黃色瘤患者中10例患者甘油三酯和總膽固醇水平較高，其中3例患者α-載脂蛋白水平較高。

3討論

眼瞼黃色瘤是一種良性眼瞼腫瘤，是黃色瘤最常發(fā)生的部位?？砂l(fā)生在遺傳性血脂過(guò)高、糖尿病和其它繼發(fā)性血脂過(guò)高的患者中，但多數(shù)患者血脂正常[2]。本研究中，50%患者血脂正常，也無(wú)高脂飲食習(xí)慣，與既往研究發(fā)現(xiàn)50%眼瞼黃色瘤患者總膽固醇和甘油三酯水平正常的結(jié)果一致[3]。Hu等[4]研究給家兔喂養(yǎng)高膽固醇飲食(高膽固醇飲食對(duì)家兔脂蛋白代謝紊亂、黃色瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要作用)，促進(jìn)了黃色瘤的發(fā)生，表明黃色瘤與脂質(zhì)代謝異常有關(guān)。Kavoussi等[5]研究發(fā)現(xiàn)，高膽固醇血癥和高甘油三酯血癥的發(fā)生率在黃色瘤組和非黃色瘤組受檢者之間沒有顯著差異，但兩組受檢者膽固醇、甘油三酯、極低密度脂蛋白(VLDL)和高密度脂蛋白(HDL)平均血清值有顯著差異，表明眼瞼黃色瘤可能是篩查亞臨床動(dòng)脈粥樣硬化的皮膚征象。

眼瞼黃色瘤是由吞噬脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞(泡沫細(xì)胞)組成的，其中泡沫細(xì)胞發(fā)生在真皮毛細(xì)血管和皮膚附屬物周圍，富含膽固醇，其形成過(guò)程類似于動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程。本研究納入的眼瞼黃色瘤患者中部分患者伴有不同程度頸動(dòng)脈硬化和斑塊，其中大部分為輕度頸動(dòng)脈硬化。頸動(dòng)脈硬化和斑塊都是頸動(dòng)脈粥樣硬化的表現(xiàn)，頸動(dòng)脈粥樣硬化又是動(dòng)脈粥樣硬化的一種表現(xiàn)形式[6]，故推測(cè)眼瞼黃色瘤與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)。Dey等[7]研究表明，眼瞼黃色瘤與高血壓、高血脂、向心性肥胖、糖尿病、心血管疾病等有關(guān)。另有研究發(fā)現(xiàn)，與健康受試者相比，眼瞼黃色瘤患者發(fā)生缺血性心臟病、心肌梗塞的風(fēng)險(xiǎn)增加，而且早死風(fēng)險(xiǎn)增加，但與總膽固醇或甘油三酯水平是否升高無(wú)關(guān)，提示眼瞼黃色瘤是亞臨床動(dòng)脈粥樣硬化階段，早期冠狀動(dòng)脈病變的表現(xiàn)之一。

表1 MSR1基因引物序列

引物名稱引物序列D154-MRS1-S2-FTCTGTCCTAATGTCTCCACCTCD154-MRS1-S2-RTGCCTACACCAAGTCATCTCTD154-MRS1-S3-FGTAATGAGCCCAATTTCCACAATACD154-MRS1-S3-RGCCTCCTAGCAATGAGAACTCD154-MRS1-S4-FGTTGTAGGTAAAGAAGTATGGGTGTTD154-MRS1-S4-RAAGGCTCTCGGTAGACTCCD154-MRS1-S5-F2ATGGTATAGACTGTGAGAGGAATTD154-MRS1-S5-R2CCTGAGGATTACTGAACTTATGC

表2 MRS1基因SNP純合突變位點(diǎn)

外顯子區(qū)域SNP位點(diǎn)突變患者多數(shù)患者S2-SNP1TTTATA[G/C]ATAAGGC(1例頸動(dòng)脈硬化)GS5-SNP1TTTGCA[A/G]TAAATGAAS5-SNP2GTCAGG[G/A]TATAATA(3例高血脂)AGS5-SNP3TTATGT[G/C]CCCTTAGGS5-SNP4ACAAGA[T/C]GAAATCC(3例高血脂)CTS5-SNP5ATTGGC[A/G]TGCTTCGAG

Govorkova等[8]通過(guò)回顧性研究發(fā)現(xiàn)，眼瞼黃色瘤的炎癥環(huán)境類似于心臟動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的早期階段，動(dòng)脈粥樣硬化的主要危險(xiǎn)因素是由脂質(zhì)過(guò)氧化、糖氧化及炎癥細(xì)胞因子分泌增多等機(jī)制導(dǎo)致的動(dòng)脈內(nèi)膜炎癥。動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)受體—MSR1是A型清道夫受體(SR-A)中的一種，是單核巨噬細(xì)胞表面的一種跨膜糖蛋白的三聚體，通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。在動(dòng)脈粥樣硬化早期，MSR1從血管壁清除修飾的低密度脂蛋白，從而減少血管壁的損傷，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。SR-A可以作為脂蛋白受體參與動(dòng)脈粥樣硬化病變的形成，也可以在細(xì)胞粘附、宿主防御、細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用[9]。此外，Nicoletti等[10]發(fā)現(xiàn)SR-A可以介導(dǎo)修飾抗原的攝取，并將其表達(dá)給抗原特異性T細(xì)胞，表明清道夫受體參與氧化蛋白抗原的免疫識(shí)別。

巨噬細(xì)胞參與許多疾病的病理過(guò)程，靶向治療如何將治療分子傳遞給巨噬細(xì)胞是一個(gè)重要問(wèn)題。Matsui等[11]為了靶向治療將過(guò)氧化物酶(PRXs)傳遞給巨噬細(xì)胞，設(shè)計(jì)了羧乙基醚基團(tuán)修飾過(guò)氧化物酶(CEE-PRXs)，以促進(jìn)其與巨噬細(xì)胞SR-A的相互作用。本研究發(fā)現(xiàn)，1例眼瞼復(fù)發(fā)眼瞼黃色瘤患者第2條外顯子區(qū)域S2-SNP1位點(diǎn)發(fā)生純合突變，且患者動(dòng)脈粥樣硬化明顯，分析該位點(diǎn)突變與眼瞼黃色瘤及動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展相關(guān)，但是病例數(shù)較少，需要更多病例研究來(lái)說(shuō)明其意義。另有3例患者第5條外顯子區(qū)域S5-SNP2、S5-SNP4位點(diǎn)發(fā)生純合突變，均伴有甘油三酯或總膽固醇增高和輕度動(dòng)脈硬化，說(shuō)明該位點(diǎn)的突變有促進(jìn)血脂增高和動(dòng)脈硬化的風(fēng)險(xiǎn)。上述3處SNP位點(diǎn)的突變均與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)。此外，我們發(fā)現(xiàn)眼瞼黃色瘤患者和健康人的MSR1單核苷酸多態(tài)性無(wú)明顯差異，分析可能是其它MSR改變，未來(lái)可以進(jìn)一步研究MSR其它受體基因的單核苷酸多態(tài)性，探討眼瞼黃色瘤的發(fā)病機(jī)制與動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)性。

黃色瘤在皮膚、肌腱和筋膜的結(jié)締組織中形成泡沫細(xì)胞簇，偶爾在骨膜中形成。眼瞼黃色瘤通常為黃色，是由于油脂中含有胡蘿卜素2。黃色瘤與動(dòng)脈粥樣硬化、血栓性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，黃色瘤的發(fā)展可能預(yù)示著嚴(yán)重的代謝和心血管疾病以及淋巴增生性惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)升高[12]，需要開展更多的實(shí)驗(yàn)和臨床研究來(lái)揭示黃色瘤的發(fā)病機(jī)制及其與缺血性心臟病等疾病的關(guān)系。