羊膜淚小管支架治療去勢雄兔干眼癥的實驗研究

黎 彪，袁 晴，朱佩文，林 啟，閔幼蘭，石文卿，葉 蕾，邵 毅

0引言

現(xiàn)如今，由于激素水平的改變、長時間閱讀或使用電腦、屈光手術(shù)、角結(jié)膜接觸鏡的使用、頻繁滴用眼藥水等因素的影響，干眼癥在世界各地的發(fā)病率有上升趨勢，可達5%～35%，其作為導(dǎo)致慢性眼表疾病最常見原因之一，是一種治療較為困難的慢性疾病[1-3]。由于淚膜穩(wěn)定性下降，引起患者視疲勞、眼干、持續(xù)性紅腫、視力波動、眼內(nèi)異物感等不適，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[4]。目前，針對不同的病因和患者自身的情況，治療干眼癥的方法主要有抗炎藥物、抗氧化劑[5]、人工淚液、激素替代治療、淚道栓塞等，但均存在不良反應(yīng)，療效也不盡相同。其中淚道栓塞對于患者的治療有較好的效果，但由于材料的局限性，對患者可能帶來較強的異物感而不易被接受。

羊膜淚小管支架以羊膜為主要材料，將其填入淚道，可以通過堵塞淚道的方式，一定程度上保留殘留淚液，從而達到治療干眼癥的目的。同時，相比于目前常用的材料，羊膜淚小管支架具有抑制新生血管形成、抗原性低、炎性反應(yīng)輕和抑制瘢痕增生等優(yōu)勢[6-7]?，F(xiàn)為探究羊膜支架栓塞淚小管對手術(shù)閹割雄兔干眼癥的治療作用，為淚小管栓塞治療干眼癥提供實驗依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料成年新西蘭雄兔，體質(zhì)量1.5～2.0kg(由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供)，使用裂隙燈顯微鏡和眼底顯微鏡篩選出36只無眼疾的健康雄兔，在安靜且恒溫的環(huán)境下喂養(yǎng)。將36只雄性兔隨機均分為3組，每組12只，其中A組為假閹割手術(shù)組，B組為假植入組，C組為羊膜淚小管支架組。本次實驗全部選用雄兔的右眼進行，實驗期間保持對所選雄兔的正常飼養(yǎng)。本實驗研究符合動物倫理委員會的要求[8]，充分考慮了實驗動物的利益，減少對實驗動物損傷和痛苦，尊重動物的生命。

1.2方法

1.2.1手術(shù)方法本次實驗所有操作和檢查均由同一人于相同操作條件下完成。切去所選36只雄兔的第三眼瞼，在眼部抗感染下喂養(yǎng)1wk。參照馬軼群等[9]方法，對36只雄兔進行分組，分組情況如前述，B、C兩組行雙側(cè)睪丸切除術(shù)，去除辜丸及附辜，術(shù)中對精索靜脈和輸精管行縫線打結(jié)，以閹割雄兔去勢。其中，對于A組雄兔僅切開陰囊，不切除睪丸，術(shù)后不進行其他處理。檢查造模后的所有雄性兔，B、C兩組兔角膜干燥、少光澤，角膜熒光素染色(FL)可見散在的點狀潰瘍。所有造模兔淚液分泌試驗(SⅠt)均<10mm/5min則造模成功。B、C兩組植入羊膜淚小管支架(圖1)：B組為陽性空白對照組，于閹割當(dāng)日植入羊膜淚小管支架10s后取出，觀察其眼部情況；C組為實驗組，閹割手術(shù)當(dāng)日植入羊膜淚小管支架。分別于植入前和植入后2、4、6wk行FL染色和SⅠt檢查，并使用共焦顯微鏡觀察角膜神經(jīng)變化。

1.2.2淚小管羊膜生物力學(xué)特性測定參照文獻[10]，由同一操作者將淚小管羊膜切割，獲取3.5cm×1.0cm的實驗樣本，將淚小管羊膜放在符合傳感器中施力拉伸，待其斷裂后記錄其抗拉強度(MPa)、斷裂伸長率(%)和彈性模量(MPa)。

1.2.3淚液分泌試驗彎折刻度濾紙，置于眼內(nèi)結(jié)膜囊的中外1/3處，5min后取出濾紙，量其浸潤長短。按照文獻的標(biāo)準(zhǔn)[11]，若所量得長度<5mm/5min則為干眼。

1.2.4 FL染色和評分于雄兔的結(jié)膜囊內(nèi)滴1%熒光素鈉，使其眨眼，獲取其FL圖像并觀察角膜上皮的染色情況。采用12分法進行評分[12]：角膜分4個區(qū)域，每區(qū)域得分0～3分，0分：未見染色；1分：染色<5個點；2分：染色≥5個點；3分：≥5個點并有潰瘍或絲狀物染色。

1.2.5共焦顯微鏡檢查檢查實驗兔角膜神經(jīng)的變化情況，用非侵入性共聚焦顯微鏡掃描角膜神經(jīng)，具體操作參考文獻[13]：固定兔頭，用5g/L鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉兔眼，調(diào)整實驗兔，使其平視正前方，每次操作由同一操作者逐漸慢速推進鏡頭，中央角膜處行全層掃描，獲取所需角膜神經(jīng)圖像。

1.2.6神經(jīng)密度的測定為單個圖像中神經(jīng)纖維的總長度。通常在35～50μm的深度觀察角膜下神經(jīng)叢。角膜下神經(jīng)纖維的長度由AUTOCAD軟件確定。為了計算神經(jīng)纖維密度，調(diào)整每個圖像的尺度，使得每幀對應(yīng)于0.16mm2(400μm×400μm)的實際角膜面積。使用折線命令描繪神經(jīng)纖維的形狀。所有的神經(jīng)纖維被描繪在單個圖像中，然后復(fù)制所有描繪的折線(圖2)，所有折線的總長度通過折線的特征來確定。隨后，將測得總長度除以面積(0.16mm2)，即神經(jīng)纖維密度(mm/mm2)。

2結(jié)果

2.1淚小管支架的生物力學(xué)特性比較羊膜淚小管支架的抗張強度為0.709±0.187MPa，斷裂伸長率為15.653%±3.023%，而羊膜淚小管支架彈性模量為3.132±1.382MPa，顯示淚小管羊膜有一定彈性和抗拉伸性能。

2.2三組羊膜淚小管支架植入前后FL染色與SⅠt結(jié)果比較植入羊膜淚小管支架前后，各組FL染色圖像：(1)A組角膜表面光滑、清晰，F(xiàn)L染色不明顯(圖3A、D)；(2)B組角膜表面粗糙，角膜上皮可見點片狀染色(圖3B、E)；(3)C組角膜表面較假手術(shù)組更為光滑、清晰，無明顯點狀染色(圖3C、F)。三組不同時間的FL評分和SⅠt結(jié)果比較，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析：(1)三組間FL評分比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組間=18.542，P組間=0.004；F時間=16.858，P時間=0.007；F交互=13.653，P交互=0.009)；(2)三組間SⅠt結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F組間=15.764，P組間=0.011；F時間=19.781，P時間=0.007；F交互=22.251，P交互=0.003)。植入淚小管支架前，三組間FL評分和SⅠt兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。羊膜淚小管支架植入6wk后，C組FL評分和SⅠt與植入前比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；且B組FL評分和SⅠt與植入前比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。B組和C組植入淚小管支架后2、4、6wk時三個時間點FL評分和SⅠt結(jié)果兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05，表1)。

圖1B、C組羊膜淚道支架植入示意圖A：麻醉后充分暴露兔眼淚小點；B～D：用眼科顯微平鑷將羊膜淚小管支架沿淚小管走形植入，圖B部分植入(植入10s后取出)，圖C大部分植入(植入后保留6wk)，圖D完全植入。

組別眼數(shù)干預(yù)前干預(yù)后2wk干預(yù)后4wk干預(yù)后6wkFL染色(分) A組121.05±0.401.04±0.220.96±0.281.07±0.31 B組121.00±0.452.10±0.53e3.12±0.64e3.35±0.73e C組121.10±0.331.94±0.64a,c,e2.91±0.91a,c,e3.06±0.75a,c,eSⅠt(mm/5min) A組129.84±1.959.92±1.959.85±2.069.97±1.99 B組129.69±1.557.63±1.65e6.24±1.99e4.58±1.61e C組129.96±1.648.41±2.04a,c,e6.64±1.06a,c,e5.11±1.30a,c,e

注：A組：假閹割手術(shù)組；B組：假植入組；C組：羊膜淚小管支架組。aP<0.05vsA組；cP<0.05vsB組；eP<0.05vs干預(yù)前。

組別眼數(shù)干預(yù)前干預(yù)后2wk干預(yù)后4wk干預(yù)后6wk神經(jīng)纖維密度(mm/mm2) A組1220.16±4.9920.09±4.54e20.96±4.73e20.21±4.85e B組1216.67±2.4116.22±2.55e16.89±2.59e16.39±2.76e C組1216.19±2.3917.12±2.61a,c,e18.93±3.12a,c,e19.14±3.51a,c,e纖維分支(分支數(shù)/圖) A組1210.54±3.0510.54±2.91e10.77±2.95e10.47±2.63e B組127.63±2.517.53±2.45e7.44±2.61e7.52±2.44e C組127.72±2.628.06±2.73a,c,e8.67±2.86a,c,e9.17±2.55a,c,e曲率評分 A組123.29±0.693.31±0.62e3.27±0.71e3.34±0.66e B組121.82±0.621.89±0.69e1.84±0.53e1.79±0.52e C組121.86±0.662.05±0.81a,c,e2.69±0.86a,c,e3.16±0.74a,c,e

注：A組：假閹割手術(shù)組；B組：假植入組；C組：羊膜淚小管支架組。aP<0.05vsA組；cP<0.05vsB組；eP<0.05vs干預(yù)前。

圖2神經(jīng)密度的測定A：CAD軟件獲得的共焦顯微圖像中的角膜神經(jīng)纖維走行(×120)；B：根據(jù)共焦顯微圖像中的角膜神經(jīng)纖維描繪的折線。

2.3各組植入淚小管支架前后角膜共焦顯微鏡圖像結(jié)果A組兔角膜上皮下神經(jīng)顯示為相對直的神經(jīng)叢，數(shù)量多，清晰可見(圖4A)。B組角膜上皮下神經(jīng)可見彎曲，數(shù)量有所減少(圖4B)。C組角膜上皮下神經(jīng)較直，與正常雄兔角膜上皮下神經(jīng)相比，數(shù)量略有減少(圖4C)。A組雄兔角膜基質(zhì)內(nèi)神經(jīng)為較清晰的直的神經(jīng)叢(圖4D)。B組角膜基質(zhì)內(nèi)神經(jīng)叢彎曲(圖4E)。C組的角膜基質(zhì)內(nèi)神經(jīng)與正常雄兔角膜基質(zhì)內(nèi)神經(jīng)比較略有彎曲(圖4F)。

2.4各組羊膜淚小管支架植入前后神經(jīng)檢查定量分析結(jié)果三組不同時間的角膜上皮下神經(jīng)纖維密度、分支或曲率評分結(jié)果比較(表2)，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析：(1)不同組間神經(jīng)纖維密度、分支或曲率評分比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.143、5.280、7.621，P=0.041、0.046、0.036)；(2)不同時間的神經(jīng)纖維密度、分支或曲率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.637、5.748、6.864，P=0.039、0.032、0.044)；(3)三組不同組間不同時間神經(jīng)纖維密度、分支或曲率評分比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=5.547、6.326、5.754，P=0.045、0.036、0.039)。

圖3三組羊膜淚小管支架植入前后FL染色和SⅠt結(jié)果A：假閹割手術(shù)組角膜表面光滑、清晰，F(xiàn)L染色不明顯；B：假植入組角膜表面粗糙，見點片狀染色；C：羊膜淚小管支架組角膜表面較清晰，無明顯點狀染色；D：假手術(shù)組角膜未見有FL染色；E：假植入組角膜上皮見染色斑點；F：羊膜淚小管支架組角膜上皮未見明顯點狀染色。

圖4各組角膜上皮下神經(jīng)叢和基質(zhì)內(nèi)層神經(jīng)叢的共焦顯微鏡圖像(×120)A、D：假閹割手術(shù)組角膜上皮下神經(jīng)叢、基質(zhì)內(nèi)層神經(jīng)叢，數(shù)量多，清晰可見；B、E：假植入組角膜上皮下神經(jīng)叢、基質(zhì)內(nèi)層神經(jīng)叢，皮下神經(jīng)可見彎曲，數(shù)量有所減少；C、F：羊膜淚小管支架組角膜上皮下神經(jīng)叢、基質(zhì)內(nèi)層神經(jīng)叢，走形略有彎曲。

3討論

干眼癥作為多因素影響的慢性眼表疾病，其主要是由于淚液的基礎(chǔ)分泌量減少，淚液加快蒸發(fā)，淚液質(zhì)量、淚膜穩(wěn)定性均降低，從而導(dǎo)致角結(jié)膜干燥，出現(xiàn)眼部不適癥狀。淚膜穩(wěn)定性受神經(jīng)、體液調(diào)節(jié)機制的調(diào)控。例如，激素水平的變化，尤其是雄激素水平的下降，是干眼發(fā)病的關(guān)鍵。有研究發(fā)現(xiàn)，低雄激素可能導(dǎo)致瞼板腺功能障礙，瞼板受損腺體分泌物減少，淚液蒸發(fā)加快[14]。因此，激素替代治療對于干眼癥的治療有著較好的療效。有研究者前期對鬼針草滴眼液預(yù)防、醫(yī)治閹割雄兔干眼癥做了相關(guān)的研究，但其作為激素替代治療的長期不良反應(yīng)仍難以確定[15-17]。而通過淚小管栓塞方式治療干眼癥，并不會引起患者體內(nèi)激素水平的改變，極大程度上減少了不良反應(yīng)的發(fā)生。

羊膜是來源于胚胎的透明組織，它本身沒有神經(jīng)、血管、淋巴管[18]，且有良好的韌性和生物相容性，因此近年來被廣泛用于眼科領(lǐng)域的各種眼表疾病，如眼表化學(xué)灼傷、結(jié)膜缺損、角膜潰瘍和穿孔、瞼球粘連、角膜炎癥和缺損等[19]。羊膜自身所具有的干細胞和細胞因子可以促進組織修復(fù)和愈合、減輕炎癥反應(yīng)、預(yù)防組織粘連等。而羊膜淚小管支架很大程度上繼承了羊膜的特性，其本身并沒有藥物的毒性作用，本實驗結(jié)果也表明，羊膜淚小管支架質(zhì)地較為柔軟，具有良好彈性和韌性，并有一定的彎曲能力和擴張度。且羊膜淚小管支架植入時簡單方便，易于操作。羊膜淚小管支架通過抑制干眼癥患者眼部的炎癥反應(yīng)，促進淚道上皮功能的恢復(fù)，抑制病變組織纖維化，一定程度上改善淚膜的穩(wěn)定性。同時，此種支架符合淚小管的解剖結(jié)構(gòu)，對淚道的摩擦程度小，極大地減少了機械損傷，并通過淚小管栓塞的方式很大程度上保留了天然淚液，穩(wěn)定了淚膜的功能，減少了患者眼干等癥狀。

淚小管栓塞較為安全、可靠，其優(yōu)勢主要體現(xiàn)在以下幾個方面：(1)極大限度地保留了天然淚液，使淚膜穩(wěn)定；(2)栓子可自動調(diào)節(jié)其直徑，以適合術(shù)眼淚小管內(nèi)徑；(3)植入后，栓子與淚小管結(jié)合緊密，不易脫落；(4)栓子不易發(fā)生外漏，降低了眼部異物感出現(xiàn)的幾率和眼部炎癥發(fā)生率。而本實驗中的羊膜淚小管支架，便是通過淚小管栓塞的方式對手術(shù)閹割雄兔的干眼癥產(chǎn)生作用。

前期的研究表明，羊膜淚道支架對于干眼癥有一定的預(yù)防作用，并著重觀察羊膜支架植入前后的FL評分和SⅠt結(jié)果，以及角膜共聚焦顯微鏡下角膜上皮基底細胞、炎癥細胞變化情況，而此次研究除了對比羊膜淚小管支架植入前后的FL評分和SⅠt結(jié)果外，進一步比較了三組動物干預(yù)后不同時間的角膜上皮下神經(jīng)纖維密度、分支或曲率評分結(jié)果。本實驗結(jié)果顯示：在植入羊膜淚小管支架后，閹割雄兔干眼癥狀和體征有所改善，表明其對干眼癥的治療有作用。植入6wk后，羊膜淚小管支架組SⅠt、FL評分較治療前有改善，而假植入組則出現(xiàn)了惡化，這說明羊膜淚小管支架通過保留淚液，對淚膜的功能具有穩(wěn)定作用。這可能是干眼癥進展的自然過程，也可能由于淚液的存留而使淚腺的功能有一定程度的改善。而對角膜上皮下神經(jīng)基質(zhì)內(nèi)神經(jīng)情況的觀察，可以發(fā)現(xiàn)羊膜淚小管支架組角膜上皮下神經(jīng)和角膜基質(zhì)層神經(jīng)干相對直，與正常雄性兔上皮下神經(jīng)相比，數(shù)量有所減少，且支架植入后2wk和4wk神經(jīng)密度、神經(jīng)數(shù)量有明顯提高，而假植入組和假手術(shù)組術(shù)后2wk和4wk神經(jīng)密度、數(shù)量增加不明顯，甚至減少。而在假植入組中，角膜上皮下神經(jīng)和角膜基質(zhì)層神經(jīng)干彎曲，數(shù)量減少。說明羊膜淚小管支架植入后角膜神經(jīng)的變性程度更低。相較于治療中常用的淚道栓子，羊膜淚小管支架不易引起淚小管硬化、感染、栓子脫落或移位等，其治療效果似乎也更具有優(yōu)勢，淚液量增加更為顯著，淚膜穩(wěn)定性改善更為明顯[20-22]。

羊膜淚小管支架可以在很大程度上改善閹割去勢雄兔干眼癥的癥狀，在減少治療的不良反應(yīng)和穩(wěn)定淚膜的功能方面都能起到一定的作用。且羊膜淚小管支架給患者帶來的異物感較低，具有一定的臨床應(yīng)用價值。但其在人干眼癥的治療過程中所可能帶來的不良反應(yīng)猶未可知。同時，其對于不同程度干眼癥的治療效果也需進一步深入研究，以便于為干眼癥的治療提供更多的實驗依據(jù)。