抗幽門螺桿菌便餐粉配方優(yōu)化及其體外抑菌研究

邱俊杰， 孫禮進(jìn)， 張忠寶， 李 浩， 張 智

(四川輕化工大學(xué)a.生物工程學(xué)院;b.化學(xué)工程學(xué)院, 四川 自貢 643000)

引 言

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)是胃炎、胃潰瘍、胃癌等多種疾病的致病因子。Hp感染率極高，在全球感染率超過50%以上，在不同的國(guó)家和地區(qū)，感染率也大不相同，在發(fā)達(dá)國(guó)家感染率為30%～50%，而發(fā)展中國(guó)家感染率高達(dá)80%以上，并且感染人群偏向低齡化[1]。幽門螺桿菌感染已于2015年被定性為傳染性疾病[2]。臨床上治療Hp的感染，多采用抗生素多聯(lián)療法，但維持時(shí)間短，而且長(zhǎng)期用藥容易造成腸道菌群混亂和耐藥性的增加，從而導(dǎo)致治療Hp的感染更加困難[3-4]。

Hp的感染與其結(jié)構(gòu)有著極大的關(guān)系[5-6]，目前已經(jīng)熟知的致病因子主要有鞭毛、黏附素、脲酶、空泡毒素、中性粒細(xì)胞激活蛋白(Neutrophil-activating protein，NAP)等。鞭毛主要為Hp提供動(dòng)力，使其可以快速穿過胃酸，到達(dá)中性的粘液層；尿素酶通過將尿素分解形成氨和二氧化碳，在菌體周圍形成氨云保護(hù)層，從而可以抵御胃酸對(duì)菌體的損傷，并有利于菌體定植胃黏膜上；當(dāng)Hp到達(dá)胃黏膜時(shí)，黏附素將與胃黏膜上皮細(xì)胞的受體緊密結(jié)合，繼而損傷上皮細(xì)胞；空泡毒素可以使靶細(xì)胞發(fā)生空泡化，細(xì)胞骨架重排，細(xì)胞死亡等形態(tài)學(xué)的改變。這些致病因子的發(fā)現(xiàn)有利于對(duì)Hp治療提供新的靶點(diǎn)，如Hp血型抗原結(jié)合粘附素(Blood group antigen binding adhesion，BabA2)、尿素酶B亞單位(urease B subunit，UreB)和鞭毛蛋白A亞單位(Flagellin A subunit，F(xiàn)laA)等作為疫苗的應(yīng)用已被建立。

卵黃抗體(Yolk antibody，IgY)是鳥類在受到某種抗原刺激時(shí)，在血液中形成特異性抗體，并將這些抗體轉(zhuǎn)移到卵黃中，其本質(zhì)是卵黃免疫球蛋白。特異性IgY通過直接與病原菌的靶點(diǎn)相結(jié)合，改變其整體結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到抑制作用，此外在消化酶的作用下，一部分IgY被分解成小肽(Fab)，被機(jī)體吸收進(jìn)入血液后，可與血液中的病原體黏附素結(jié)合，從而使其失去致病性。國(guó)內(nèi)外研究者已經(jīng)對(duì)IgY的優(yōu)越性特性有了清楚的認(rèn)識(shí)，已被廣泛應(yīng)用于食品，疾病預(yù)防，免疫檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域[7-9]。

但I(xiàn)gY存在于卵黃液中，單純的提取IgY，耗時(shí)耗力，成本高，而且造成大量蛋白質(zhì)資源的損失，甚至?xí)廴经h(huán)境。此外，雞蛋在貯存過程中，由于受外界濕度，溫度以及貯存方式等的影響，容易發(fā)生腐敗變質(zhì)[10]。

基于此，本文將高免蛋液(BabA2、UreB和FlaA免疫產(chǎn)蛋雞制備)制備成高免蛋粉，與其他配料混合，開發(fā)一種具有抗幽門螺桿菌功能的便餐粉，不僅對(duì)治療和預(yù)防Hp的感染具有重要的社會(huì)價(jià)值，還能形成新的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺 (3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine, TMB)單組份顯色液(碧云天生物科技公司)，HRP標(biāo)記的山羊抗雞抗體(美國(guó)Sigma公司)，新生胎牛血清(Invitrogen公司)，高免雞蛋(四川輕化工大學(xué)生物制藥教研室實(shí)驗(yàn)室制備)，Hp液體培養(yǎng)基、Hp選擇性添加劑(青島海博生物技術(shù)有限公司)，其他化學(xué)試劑均為分析純。

YQX-II型微需氧培養(yǎng)箱(美國(guó)Gene Science)，DHp-9160B型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，YC-3000型噴霧冷凍干燥機(jī)(上海雅程儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 高免蛋粉制備

收集高免雞蛋，清水洗凈蛋殼，去蛋清留蛋黃，稱重放入65 ℃烘箱殺菌40 min，冷卻至室溫備用。按照YC-3000噴霧冷凍干燥機(jī)說明書進(jìn)行物料器的安裝，打開通風(fēng)循環(huán)通道，關(guān)閉出水孔，保持密閉狀態(tài)，將制冷機(jī)的循環(huán)泵打開循環(huán)10 min后開始制冷，待物料器內(nèi)的溫度降至-35 ℃，安裝進(jìn)料設(shè)備，設(shè)定蠕動(dòng)速度為25 r/min，保持物料溫度為-15 ℃以下，結(jié)束進(jìn)料后，打開冷井閥門，關(guān)閉風(fēng)機(jī)，關(guān)閉物料器兩側(cè)閥門，打開真空機(jī)及真空閥門，至物料器內(nèi)真空度小于150 Pa，冷井溫度達(dá)-40 ℃，開始加熱，設(shè)定溫度為50 ℃，工作數(shù)小時(shí)后，關(guān)閉加熱，物料溫度在時(shí)間段內(nèi)不再上升時(shí)關(guān)機(jī)取料，蛋黃粉稱重。

1.2.2 便餐粉制作工藝

將燕麥米、糯米通過膨化工藝熟化；葛根洗凈，加入適量水，放入高壓蒸汽滅菌鍋中，121 ℃熟化20 min后立即取出，將其放置于100 ℃烘箱中烘干后，放入粉碎機(jī)中將其粉碎，過100目篩網(wǎng)，即得葛根粉。將燕麥粉、糯米粉，葛根粉，紫薯粉，脫脂奶粉，麥芽粉按照一定的比例混合均勻，在以上配方的基礎(chǔ)上，添加木糖醇，麥芽糊精和高免蛋粉，即得便餐粉，參考馬永軒[11]等方法，通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化配方改善便餐粉的品質(zhì)。

1.2.3 便餐粉品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定

(1) 休止角的測(cè)定：將潔凈玻璃放置于水平實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，將潔凈的漏斗放置于鐵架臺(tái)上，垂直懸空，下端距離玻璃面3 cm，準(zhǔn)確稱取便餐粉3 g，緩慢倒入玻璃漏斗，讓其自然滑落，測(cè)定堆積物的直徑和高度，各測(cè)量3次取平均值，按照tanθ=2×h/d求其休止角。

(2) 堆積密度的測(cè)定：準(zhǔn)確稱量便餐粉20 g，緩慢倒入100 mL潔凈量筒中，測(cè)定體積，重復(fù)三次求其平均值，按照質(zhì)量/體積即得堆積密度。

(3) 結(jié)塊率的測(cè)定：準(zhǔn)確稱量便餐粉30 g，加入65 ℃的溫水，攪拌至無干粉存在，靜置冷卻至室溫，用20目篩進(jìn)行過濾，濾渣用水洗凈，吹風(fēng)機(jī)吹干后，將干結(jié)物塊與篩網(wǎng)共同稱重，總質(zhì)量減去篩網(wǎng)質(zhì)量即為結(jié)塊率，重復(fù)三次。

(4) 管道流動(dòng)性的測(cè)定：準(zhǔn)確稱量便餐粉30 g，加入65 ℃的溫水 105 mL，攪拌至無干粉存在，靜置冷卻至室溫，緩慢倒入鼻飼管中，記錄5 min流出的總體積，計(jì)算出流動(dòng)速率(單位時(shí)間流出的體積mL/min)，重復(fù)3次。

(5) 管道掛壁的測(cè)定：準(zhǔn)確稱量便餐粉30 g，加入65 ℃的溫水105 mL，攪拌至無干粉存在，靜置冷卻至室溫，緩慢倒入鼻飼管中，待其全部流出后，帶鼻飼管稱重，總質(zhì)量減去鼻飼管質(zhì)量即為管道掛壁重量，重復(fù)3次。

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照1.2.3的方法，分別測(cè)定木糖醇、麥芽糊精和高免蛋粉添加量對(duì)便餐粉休止角、堆積密度、結(jié)塊率、管道流動(dòng)性和掛壁量的影響。

1.2.5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以木糖醇、麥芽糊精和高免蛋粉的添加量為因素，通過SPSS17.0軟件設(shè)計(jì)L9(33)正交表，見表1，測(cè)定每組配方的休止角、堆積密度、結(jié)塊率、管道流動(dòng)量以及掛壁量，并將每組配方?jīng)_調(diào)后隨機(jī)邀請(qǐng)人員進(jìn)行品嘗打分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2，對(duì)配方進(jìn)行優(yōu)選。

表1 正交因素水平表

表2 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.6 便餐粉效價(jià)穩(wěn)定性測(cè)定

優(yōu)選出最佳配方后，將便餐粉用全自動(dòng)包裝機(jī)包裝后，分別放入-20 ℃、4 ℃、37 ℃、65 ℃，通過間接Elisa法測(cè)定便餐粉和高免蛋粉的OD450值，具體如下：用pH=9.6的磷酸鹽緩沖液將UreB蛋白稀釋至10 ug/mL作為包被液，加入96孔板，每孔100 μL，4 ℃靜置12 h，PBST洗滌，每次3 min，重復(fù)三次；加入5%脫脂奶粉于37 ℃封閉1.5 h，PBST洗滌同上；將便餐粉和高免蛋粉稀釋2500倍后加入96孔板，每孔100 μL，37 ℃孵育2 h，PBST洗滌同上；加入二抗(HRP標(biāo)記的山羊抗雞抗體)，每孔100 μL，37 ℃反應(yīng)1 h，PBST洗滌同上；加入TMB單組份顯色液，每孔100 μL于暗處顯色5 min；最后加入1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450 nm測(cè)定吸光度，P/N>2.1為陽性(見公式1)。

P/N=(A待測(cè)樣品-A空白對(duì)照)/

(A待測(cè)陰性對(duì)照樣品-A空白對(duì)照)

(1)

1.2.7 便餐粉體外抑菌實(shí)驗(yàn)

Hp的培養(yǎng)：按照Hp固體培養(yǎng)基的配方滅菌后，冷卻至50 ℃左右，加入1/100的Hp選擇性添加劑(含1 mg/mL頭孢磺啶，0.5 mg/mL兩性霉素，1 mg/mL萬古霉素，2 mg/mL甲氧芐啶)，7%的胎牛血清，于超凈工作臺(tái)凝固30 min，取-80 ℃保存的Hp菌種50 μL涂布于培養(yǎng)基上，于微需氧培養(yǎng)箱(85%N2，10%O2，5%CO2)中培養(yǎng)5～7天，挑取單菌落于Hp液體培養(yǎng)基中，37 ℃微需氧培養(yǎng)5～7天，調(diào)整Hp菌液濃度為108CFU/mL，備用。

將便餐粉溶于Hp滅菌液體培養(yǎng)基中，0.22 μm濾膜過濾除菌，將其與等體積濃度為108CFU/mL Hp菌液混合，調(diào)整便餐粉的濃度分別為20 mg/mL、40 mg/mL和60 mg/mL，最后均加入1/100的Hp選擇性添加劑，7%的胎牛血清，放入37 ℃微需氧條件培養(yǎng)。每隔12 h在超凈工作臺(tái)收集樣品200 μL，600 nm測(cè)定吸光度。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 麥芽糊精對(duì)便餐粉品質(zhì)指標(biāo)的影響

(1) 麥芽糊精添加量為20%和25%的休止角顯著低于10%、15%和30%(44.38±0.14°、43.85±0.16° vs 47.15±0.25°、47.56±0.21°、45.66±0.23°，P<0.05)，如圖1所示。

注：圖中小寫字母表示0.05水平下的差異顯著性，下同
圖1 麥芽糊精添加量對(duì)便餐粉休止角的影響

(2) 隨著麥芽糊精添加量的增大，便餐粉的各組堆積密度之間無顯著性差異，如圖2所示。

圖2 麥芽糊精添加量對(duì)便餐粉堆積密度的影響

(3) 隨著麥芽糊精添加量的增加，便餐粉的結(jié)塊率從26.70%±1.10%降低到15.26%±0.88%各組之間呈顯著性差異(P<0.05)，如圖3所示。

圖3 麥芽糊精添加量對(duì)便餐粉結(jié)塊率的影響

(4) 隨著麥芽糊精添加量的增大，便餐粉的流量從(13.03±0.05) mL/min升高到(18.65±0.04) mL/min，如圖4所示。

圖4 麥芽糊精添加量對(duì)便餐粉流動(dòng)性的影響

(5) 麥芽糊精添加量從10%增加到15%時(shí)，掛壁量從(2.78±0.52) g增加到(2.99±0.67) g當(dāng)添加量超過20%時(shí)，掛壁量無顯著性差異，如圖5所示。

圖5 麥芽糊精添加量對(duì)便餐粉掛壁的影響

2.1.2 高免蛋粉對(duì)便餐粉品質(zhì)指標(biāo)的影響

(1) 高免蛋粉添加量從5%增加到20%時(shí)，休止角由46.32±0.42°增加到48.66±0.55°(P<0.05)，添加量大于20%時(shí)，粉體休止角無顯著性差異，如圖6所示。

圖6 高免蛋粉添加量對(duì)便餐粉休止角的影響

(2) 隨著高免蛋粉添加量從10%增加到15%，堆積密度由(0.43±0.04) g/mL降低為(0.35±0.03) g/mL(P<0.05)，添加量超過15%時(shí)，各組堆積密度之間無顯著性差異，如圖7所示。

圖7 高免蛋粉添加量對(duì)便餐粉堆積密度的影響

(3) 隨著高免蛋粉添加量的增加，結(jié)塊率由19.34%±0.54%增加到26.53%±0.44%，15%的與20%的結(jié)塊率呈現(xiàn)顯著性差異(20.71%±0.52% vs 24.34%±0.56%，P<0.05)，添加量超過20%時(shí)，各組結(jié)塊率無顯著性差異，如圖8所示。

圖8 高免蛋粉添加量對(duì)便餐粉結(jié)塊率的影響

(4) 高免蛋粉添加量為10%時(shí)，流量為(16.57±0.19) mL/min，顯著高于5%、15%、20%和25%的流量(P<0.05)，如圖9所示。

圖9 高免蛋粉添加量對(duì)便餐粉流動(dòng)性的影響

(5) 高免蛋粉添加量低于15%時(shí)，各組掛壁量無顯著性差異，20%的掛壁量顯著高于15%((2.75±0.19) g vs (2.24±0.14) g，P<0.05)，添加量超過20%時(shí)，各組掛壁量無顯著性差異，如圖10所示。

圖10 高免蛋粉添加量對(duì)便餐粉掛壁的影響

2.1.3 木糖醇對(duì)便餐粉品質(zhì)指標(biāo)的影響

(1) 隨著木糖醇的增加，休止角46.43±1.23°降低至40.01±1.09°，各組之間呈顯著性差異(P<0.05)，如圖11所示。

圖11 木糖醇添加量對(duì)便餐粉休止角的影響

(2) 隨著木糖醇添加量的增加，各組堆積密度并無顯著性差異，如圖12所示。

圖12 木糖醇添加量對(duì)便餐粉堆積密度的影響

(3) 木糖醇添加量為10%時(shí)，結(jié)塊率最小為6.70%±0.06%，與1%、5%、15%和20%添加量呈顯著性差異(P<0.05)，如圖13所示。

圖13 木糖醇添加量對(duì)便餐粉結(jié)塊率的影響

(4) 木糖醇添加量為10%和15%的流量顯著高于1%、5%和20%的流量((19.74±1.15) mL/min、(18.46±1.22) mL/min vs (10.44±0.88) mL/min、(12.51±0.88) mL/min、(12.33±0.83) mL/min，P<0.05)，如圖14所示。

圖14 木糖醇添加量對(duì)便餐粉流動(dòng)性的影響

(5) 隨著木糖醇添加量的增加，各組掛壁量之間無顯著性差異，如圖15所示。

圖15 木糖醇添加量對(duì)便餐粉掛壁的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

三個(gè)因素對(duì)便餐粉綜合得分的影響順序?yàn)椋焊呙獾胺?麥芽糊精>木糖醇，最佳組合為A2B2C1，即麥芽糊精添加量為20%，高免蛋粉添加量為15%，木糖醇添加量為10%，見表3。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各組的品質(zhì)指標(biāo)的測(cè)定，見表4。通過SPSS17.0軟件分析評(píng)分與五個(gè)指標(biāo)之間的相關(guān)性，休止角，結(jié)塊率與評(píng)分呈顯著性負(fù)相關(guān)(P<0.05)，流動(dòng)性與評(píng)分呈極顯著性負(fù)相關(guān)(P<0.01)，見表5。

表4 各組品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

表5 得分與指標(biāo)之間的相關(guān)性

*：相關(guān)性顯著(P<0.05)；**：相關(guān)性極顯著(P<0.01)

2.3 便餐粉效價(jià)穩(wěn)定性檢測(cè)

連續(xù)測(cè)定4個(gè)月同一批次的高免蛋粉及便餐粉OD450值，如圖16與圖17所示。高免蛋粉和便餐粉在4 ℃和37 ℃時(shí)的各組OD450值無顯著性差異，在65 ℃時(shí)的OD450值均顯著低于4 ℃和37 ℃(P<0.05)。經(jīng)P/N計(jì)算，高免蛋粉在65 ℃條件下2個(gè)月后效價(jià)已成陰性(P/N<2.1)，而便餐粉效價(jià)在4個(gè)月檢測(cè)期內(nèi)均為陽性(P/N>2.1)。

圖16 溫度對(duì)高免蛋粉效價(jià)影響

圖17 溫度對(duì)便餐粉效價(jià)的影響

2.4 便餐粉體外抑菌

隨著便餐粉濃度的增加，同一時(shí)刻的OD600值逐漸降低(P<0.05)，當(dāng)便餐粉濃度達(dá)60 mg/mL時(shí)，在72 h內(nèi)，各組的OD600值無顯著性差異，如圖18所示。

圖18 便餐粉體外抑菌結(jié)果

3 討 論

目前高免蛋液干燥的方法主要是熱風(fēng)噴霧干燥，許多研究者利用此干燥方法獲得的高免蛋粉可以代替抗生素治療某些疾病[12]，但在此過程中，高溫會(huì)影響IgY的活性。在本研究中，采用噴霧冷凍干燥生產(chǎn)的高免蛋粉，在常溫下4個(gè)月內(nèi)保持高效價(jià)，并且所得的產(chǎn)物為粉末狀，復(fù)水性好，乳化性強(qiáng)(未發(fā)表數(shù)據(jù))。說明噴霧冷凍干燥更適合高免蛋液的工業(yè)化生產(chǎn)，與其他研究者得出結(jié)論一致[13-14]。

通過膨化技術(shù)獲得的膨化粉稠度高，更有利于便餐粉口感的調(diào)節(jié)，但遇水容易形成糊化層，不易溶解，形成結(jié)塊[11]。市場(chǎng)上的粉劑產(chǎn)品多采用添加食品添加劑的方法加快粉劑溶解，眾所周知，食品添加劑的副作用眾多。因此本研究通過調(diào)整配方的添加量?jī)?yōu)化便餐粉的沖調(diào)性和溶解性，單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)麥芽糊精和木糖醇可以降低便餐粉結(jié)塊率，可能是破壞了糊化層的形成，高免蛋粉由于油脂含量高結(jié)合膨化粉糊化層的形成，導(dǎo)致結(jié)塊率提高。通過正交實(shí)驗(yàn)得出高免蛋粉，木糖醇和麥芽糊精對(duì)便餐粉品質(zhì)的影響程度，并且得出了休止角、結(jié)塊率、流動(dòng)性與綜合得分的相關(guān)性，為便餐粉的進(jìn)一步優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他粉劑產(chǎn)品的研發(fā)提供了新的思路。

通過持續(xù)監(jiān)測(cè)高免蛋粉和便餐粉的OD450值，我們發(fā)現(xiàn)，高免蛋粉與便餐粉在低溫環(huán)境下，效價(jià)可維持更長(zhǎng)時(shí)間，所以此便餐粉適于低溫保存，并且在65 ℃的條件下，便餐粉的效價(jià)可維持4個(gè)月以上，而高免蛋粉僅能維持2個(gè)月左右，推測(cè)便餐粉中的配料對(duì)IgY存在保護(hù)作用，體外抑菌實(shí)驗(yàn)表明便餐粉可抑制Hp的生長(zhǎng)，并且當(dāng)濃度達(dá)到60 mg/mL時(shí)，即可在時(shí)間段內(nèi)達(dá)到完全抑制的效果。說明了制備出的便餐粉具有治療Hp感染的潛能。