復(fù)方黃芪益氣口服液對(duì)AFB1所致大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

嚴(yán)文瑞,王玲芝,2,候玲玲,張立偉*

(1化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西大學(xué)分子科學(xué)研究所,太原 030006;2山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院;*通訊作者,E-mail:lwzhang@sxu.edu.cn)

黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是由黃曲霉菌寄生曲霉菌等產(chǎn)毒菌株所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,毒性是氰化物的10倍、砒霜的68倍,短期暴露可引起人體及動(dòng)物肝細(xì)胞壞死、中毒性肝炎、膽管增生、免疫抑制等急性肝損傷,長期暴露會(huì)引發(fā)肝癌[1]。在溫?zé)岢睗竦牡貐^(qū)一些糧食及其加工產(chǎn)品,主要是稻谷、玉米、豆類等含水量高的作物及其糧油制品AFB1污染嚴(yán)重,對(duì)人和動(dòng)物的健康造成了極大的危害[2]。我國南方由于地處濕熱地帶,AFB1污染十分嚴(yán)重,如何減少和消除AFB1對(duì)人和動(dòng)物造成的危害是當(dāng)今的一大難題[3]。

復(fù)方黃芪益氣口服液是以黃芪為君藥,佐以黨參、大棗、甘草,采用現(xiàn)代制劑工藝和技術(shù)制成的口服劑。黃芪是山西的道地藥材,其藥用迄今已有2 000多年的歷史,能增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能[4]。已有研究表明,黃芪多糖可用來治療AFB1誘發(fā)的肝損傷,具有顯著的抗氧化及脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)作用[5],黃芪甲苷也具有增強(qiáng)免疫力和保護(hù)肝臟的作用[6],為本課題提供了理論依據(jù)。本課題組前期研究表明,復(fù)方黃芪益氣口服液具有提高免疫、抗應(yīng)激、抗氧化等功能[7],臨床用于氣虛、血虛、氣血兩虛的病人,對(duì)體力恢復(fù)、癥狀改善有明顯的療效[8]。然而,目前尚無其對(duì)AFB1造成肝損傷的保護(hù)和治療作用的研究報(bào)道,因此,本研究探討復(fù)方黃芪益氣口服液對(duì)AFB1造成的大鼠急性肝損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Wistar 6周齡大鼠40只,SPF級(jí),體質(zhì)量200-220 g,購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK-(京)2016-0002。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境:山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,設(shè)施使用許可證號(hào)SYXK(晉)2017-0001,由獲得資格認(rèn)可的人員飼養(yǎng),12/12 h照明/黑暗。大鼠在清潔干燥的標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)盒內(nèi)喂養(yǎng);動(dòng)物房溫度控制在(23±1)℃,濕度控制在50%±10%。飼料為滅菌全價(jià)大鼠顆粒飼料,飲用過濾純凈水。

1.2 藥物及試劑

復(fù)方黃芪益氣口服液(本實(shí)驗(yàn)室制備,黃芪、黨參、大棗和甘草四味水煎)。AFB1標(biāo)準(zhǔn)品(純度>99%,新加坡);水飛薊賓(批號(hào):YS8031503,編號(hào):CV98613-1g,上海思域化工科技有限公司);谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程有限公司);二甲基亞砜(DMSO,批號(hào)20161008,天津市大茂化學(xué)試劑廠);大笨鐘特級(jí)初榨橄欖油(中歐天然食品股份有限公司)。

1.3 主要儀器

全自動(dòng)生化分析儀,金西盟(北京)儀器有限公司(中國總公司);FM200A高剪切分散乳化機(jī),上海弗魯克科技發(fā)展有限公司;FA-B型電子分析天平,上海右科儀器儀表有限公司。

1.4 造模及分組

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d,隨機(jī)分為5組:空白組、溶劑對(duì)照組(DMSO組)、模型組、陽性藥物對(duì)照組(陽性對(duì)照組)、復(fù)方黃芪益氣口服液組(口服液組),每組8只:大鼠分組后禁食過夜,稱重,模型組、陽性對(duì)照組、口服液組大鼠以2 mg/kg的AFB1(溶于12.5% DMSO水溶液中)單劑量灌胃以誘導(dǎo)急性AFB1肝損傷,空白組給予等量的水,DMSO組給予等量的DMSO。以AFB1灌胃造模的同時(shí),陽性對(duì)照組給予100 mg/kg水飛薊賓(溶于橄欖油中),口服液組按照人臨床服用標(biāo)準(zhǔn)換算劑量為2 ml/kg復(fù)方黃芪益氣口服液,DMSO組、模型組和空白組灌胃等量的水,每日1次,持續(xù)3 d。給藥3 d禁食過夜,稱取大鼠體質(zhì)量,麻醉后迅速腹腔主動(dòng)脈取血,離心,取血清-20 ℃保存;取肝臟,生理鹽水清洗后吸干稱重;取適當(dāng)大小肝組織浸泡在甲醛溶液中,充分固定后用于組織病理學(xué)觀察,其余肝組織于液氮冷凍后,-80 ℃保存。

1.5 肝指數(shù)檢測(cè)

取出肝臟后迅速稱量肝濕重,肝指數(shù)=(肝濕重/體質(zhì)量)×100%。

1.6 肝組織病理學(xué)變化觀察

肝組織在甲醛溶液中充分固定,常規(guī)石蠟包埋、切片,蘇木素染色,光學(xué)顯微鏡觀察肝組織結(jié)構(gòu)及其病理變化。

1.7 血清肝功能指標(biāo)測(cè)定

腹主動(dòng)脈取血,3 000 r/min,4 ℃離心10 min分離血清,用于全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、AST和ALP活性及TBIL含量。

1.8 肝組織抗氧化指標(biāo)測(cè)定

準(zhǔn)確稱取肝組織,解凍后加入9倍體積預(yù)冷生理鹽水,迅速用電動(dòng)分散機(jī)勻漿,于4 ℃,2 500 r/min,離心10 min,取上清即為待測(cè)肝臟勻漿。按試劑盒說明檢測(cè)肝臟勻漿總蛋白含量和抗氧化指標(biāo)MDA、SOD、CAT和GSH-PX含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 19.0軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,以單因素方差分析進(jìn)行顯著性比較,數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,用GraphPad Prism 5作圖。

2 結(jié)果

2.1 大鼠健康狀況

實(shí)驗(yàn)期間無大鼠死亡,空白組和DMSO組大鼠食欲良好,毛色正常,周身順滑有光澤,反應(yīng)敏捷,行為迅速;模型組大鼠食欲減退,精神不振,毛色黯淡,活躍度下降;陽性對(duì)照組和口服液組較模型組狀況有所改善。

2.2 肝肉眼觀察變化

空白組與DMSO組肝臟表面呈現(xiàn)正常的暗紅色;模型組肝臟發(fā)黃,表面有輕微出血點(diǎn);陽性對(duì)照組和口服液組肝臟輕微發(fā)黃,表面無出血點(diǎn),較模型組有所改善。

2.3 復(fù)方黃芪益氣口服液對(duì)大鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)的影響

由表1可知,實(shí)驗(yàn)前各組間大鼠體質(zhì)量不存在顯著差異,實(shí)驗(yàn)處理3 d,除空白組和DMSO組外,其余組大鼠體質(zhì)量增長緩慢甚至負(fù)增長,空白組與模型組有顯著性差異(P<0.05),說明AFB1會(huì)抑制大鼠體質(zhì)量增長;陽性對(duì)照組、口服液組的體質(zhì)量增長量較模型組有所改善,但效果不明顯,其原因可能與實(shí)驗(yàn)天數(shù)短有關(guān)。

表1 復(fù)方黃芪益氣口服液對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

(n=8,g)

Table 1 Effect of Fufang Huangqi Yiqi oral liquid on body weight in AFB1-treated rats(n=8,g)

動(dòng)物分組實(shí)驗(yàn)前體質(zhì)量實(shí)驗(yàn)后體質(zhì)量體質(zhì)量增長量 空白組235.8±11.4259.4±11.723.56±3.64 DMSO組236.4±7.5260.8±7.624.33±5.02模型組238.4±8.7236.5±9.3#-1.9±8.87#陽性對(duì)照組236.9±8.5235.4±14-0.3±9.35口服液組235.1±4.2237.8±8.22.6±6.92

與正常組比較,#P<0.05

由圖1可見實(shí)驗(yàn)處理3 d,模型組與DMSO組、空白組比較,肝指數(shù)明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陽性對(duì)照組、口服液組與模型組相比肝指數(shù)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 大鼠肝組織病理學(xué)變化

對(duì)大鼠肝組織病理學(xué)變化進(jìn)行觀察,空白組和DMSO組大鼠的肝組織結(jié)構(gòu)正常,肝小葉清晰且結(jié)構(gòu)完整;肝細(xì)胞多呈多邊形,以中央門靜脈為中心呈放射狀整齊排布,胞質(zhì)均勻,細(xì)胞核位于細(xì)胞中心呈圓形,核仁清晰,無明顯異常變化(見圖2)。模型組大鼠的肝組織結(jié)構(gòu)異常,肝小葉結(jié)構(gòu)不完整;肝細(xì)胞明顯腫脹,大量變性甚至壞死;匯管區(qū)有嚴(yán)重膽管增生且伴有炎細(xì)胞浸潤,匯管區(qū)明顯增寬(見圖2)。陽性對(duì)照組大鼠的肝組織結(jié)構(gòu)較正常組有所改善,肝細(xì)胞腫脹程度減輕,炎癥浸潤現(xiàn)象顯著減輕,但仍可見不同程度的病變(見圖2)。復(fù)方黃芪益氣口服液干預(yù)后的肝組織切片顯示,大鼠的肝組織基本恢復(fù)至正常,肝細(xì)胞索排列規(guī)則,且沒有出現(xiàn)肝細(xì)胞變性、腫脹及匯管區(qū)炎癥浸潤等現(xiàn)象無明顯異常變化(見圖2)。

與正常組比較,#P<0.05;與模型組比較,*P<0.05圖1 復(fù)方黃芪益氣口服液對(duì)大鼠肝指數(shù)的影響Figure 1 Effect of Fufang Huangqi Yiqi oral liquid on liver index in AFB1-treated rats

圖2 肝組織病理學(xué)形態(tài)變化 (×200)Figure 2 Pathological changes of liver tissue in different groups (×200)

2.5 復(fù)方黃芪益氣口服液對(duì)大鼠血清肝功能生化指標(biāo)的影響

對(duì)大鼠血清ALT、AST、ALP和TBIL使用試劑盒進(jìn)行測(cè)試,結(jié)果見圖3。模型組大鼠血清ALT、AST、ALP和TBIL明顯高于空白組和DMSO組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),這與肝指數(shù)和肝臟病理切片的結(jié)果相符。與模型組比較,陽性對(duì)照組和口服液組明顯抑制了AFB1引起的血清肝功能生化指標(biāo)的急劇升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中ALP基本恢復(fù)至正常水平。

與正常組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組,*P<0.05,**P<0.01圖3 復(fù)方黃芪益氣口服液對(duì)大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL的影響Figure 3 Effect of Fufang Huangqi Yiqi oral liquid on serum ALT, AST, ALP and TBIL in AFB1-treated rats

2.6 復(fù)方黃芪益氣口服液對(duì)大鼠肝臟脂質(zhì)過氧化的影響

肝臟MDA含量可間接反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化嚴(yán)重程度及細(xì)胞受損情況,可以作為評(píng)價(jià)復(fù)方黃芪益氣口服液抑制AFB1誘發(fā)大鼠肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的指標(biāo)。模型組大鼠攝入高劑量AFB1會(huì)導(dǎo)致大鼠肝臟脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著上升(P<0.01,見圖4),口服液組MDA含量極顯著低于模型組(P<0.01),與陽性對(duì)照組相當(dāng)且恢復(fù)到正常水平。

與正常組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組,*P<0.05,**P<0.01圖4 復(fù)方黃芪益氣口服液對(duì)大鼠肝臟中MDA含量的影響Figure 4 Effect of Fufang Huangqi Yiqi oral liquid on the level of MDA in liver tissues of AFB1-treated rats

2.7 復(fù)方黃芪益氣口服液對(duì)大鼠肝組織抗氧化指標(biāo)的影響

肝組織中CAT、SOD、GSH-PX的活性水平可以直接反應(yīng)肝臟的抗氧化能力,可作為評(píng)價(jià)復(fù)方黃芪益氣口服液提高AFB1誘發(fā)大鼠肝臟抗氧化應(yīng)激損傷的指標(biāo)。由圖5可知,模型組與DMSO組、空白組比較,肝組織中CAT、SOD、GSH-PX活性顯著降低(P<0.05);連續(xù)服用復(fù)方黃芪益氣口服液3 d,口服液組與模型組相比大鼠肝臟中CAT、SOD、GSH-PX活性明顯增強(qiáng),其中SOD和GSH-PX都恢復(fù)到了正常水平,CAT活力顯著改善(P<0.05)。

3 討論

肝臟是AFB1的主要靶器官,AFB1暴露會(huì)引起肝臟和肝細(xì)胞的嚴(yán)重受損,肝臟受損表現(xiàn)為肝指數(shù)降低[9],本實(shí)驗(yàn)中復(fù)方黃芪益氣口服液的干預(yù)可以抑制肝指數(shù)的降低;肝臟受損病理表現(xiàn)為膽管增生,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,肝細(xì)胞索不明顯,肝細(xì)胞壞死,崩裂,細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)消失[10]。本實(shí)驗(yàn)AFB1干預(yù)的肝臟病理觀察結(jié)果與上述表現(xiàn)相符,而用復(fù)方黃芪益氣口服液治療的大鼠肝臟病理切片顯示肝細(xì)胞損傷顯著改善,出現(xiàn)修復(fù)性病灶。肝細(xì)胞受損表現(xiàn)為細(xì)胞膜通透性增加,ALT和AST通過細(xì)胞膜進(jìn)入血液,使得血清中ALT和AST急劇增加,故血清ALT和AST水平的高低是反映肝細(xì)胞損傷程度的特異性指標(biāo)[11]。在本實(shí)驗(yàn)中,大鼠服用AFB1后,ALT和AST含量顯著升高,而用復(fù)方黃芪益氣口服液干預(yù)的大鼠血清中ALT和AST水平顯著降低,這表明復(fù)方黃芪益氣口服液能夠起到干預(yù)AFB1所致肝損傷的作用。肝臟的病理性損傷也會(huì)引起ALP和TBIL的異常升高,復(fù)方黃芪益氣口服液干預(yù)的大鼠ALP和TBIL顯著降低,這進(jìn)一步表明復(fù)方黃芪益氣口服液能夠起到干預(yù)AFB1所致肝損傷的作用。

與正常組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組,*P<0.05,**P<0.01圖5 復(fù)方黃芪益氣口服液對(duì)大鼠肝臟中SOD、CAT、GSH-PX含量的影響Figure 5 Effect of Fufang Huangqi Yiqi oral liquid on the levels of hepatic SOD, CAT and GSH-PX in AFB1-treated rats

AFB1致肝損傷的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激密切相關(guān),肝臟酶系在代謝過程中生成大量自由基,AFB1會(huì)導(dǎo)致自由基介導(dǎo)損傷,主要表現(xiàn)就是脂質(zhì)過氧化;還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化酶水平降低,引起機(jī)體氧化應(yīng)激損傷[12,13]。MDA是脂質(zhì)過氧化過程中的重要產(chǎn)物,它反映了體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的氧化程度和細(xì)胞遭受自由基損傷的程度;SOD為最重要的抗氧化酶之一,有著防止細(xì)胞氧化損傷的作用;GSH-PX、CAT能夠間接地反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[14,15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,復(fù)方黃芪益氣口服液可顯著降低大鼠肝組織MDA水平,同時(shí)顯著提高肝組織CAT、SOD和GSH-PX水平,提示復(fù)方黃芪益氣口服液含有抗氧化的活性物質(zhì)和具有提高體內(nèi)抗氧化酶活力的作用。即復(fù)方黃芪益氣口服液可能通過提高大鼠機(jī)體的抗氧化能力,發(fā)揮治療AFB1所致肝損傷作用。

綜上所述,復(fù)方黃芪益氣口服液能有效抑制AFB1引起的大鼠肝指數(shù)下降,改善肝組織病理性損傷,降低血清ALT、AST、ALP活力及TBIL水平,改善肝組織病理變化,減輕大鼠肝臟脂質(zhì)過氧化水平,并顯著提高肝臟SOD、CAT及GSH-Px活力。研究結(jié)果提示,復(fù)方黃芪益氣口服液具有保護(hù)肝組織和治療AFB1所致肝損傷的功能。