桑白皮提取物中桑根酮C、桑根酮D及桑辛素的HPLC含量測定

魏 敏，杜鴻靈，金 玲，施翠英，張舜杰，李秋霞，王金蘭，張 旭

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，教育部中藥材標(biāo)準(zhǔn)化重點實驗室，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，成都中醫(yī)大養(yǎng)生保健科技有限公司，四川 成都 611137 )

桑白皮為?？浦参锷orusalbaL.的干燥根皮[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性寒，味甘，歸肺經(jīng)，具有瀉肺平喘、利水消腫之功效，常用于肺熱喘咳、水腫脹滿尿少、面目肌膚浮腫等[2-4]。諸多文獻(xiàn)報道，桑屬植物的根皮中主要含黃酮類、香豆素類、芳香苯駢呋喃衍生物、多糖等多種化學(xué)成分[5]。其中，黃酮類成分桑根酮C、桑根酮D[3，4]具有降血壓、抑菌的作用[6]，而降血壓作用尤為明顯；桑辛素(又稱桑根白皮素)，具有抗腫瘤[7]、抗菌[8]、鎮(zhèn)痛[9]、抗HIV[10]的藥理作用。由此可見，此3種黃酮類成分均為桑白皮中重要的有效成分，但2015年版《中國藥典》(一部)并未收載有關(guān)桑白皮中有效成分的含量測定方法。目前，雖有同時對桑白皮中桑根酮C、桑根酮D的HPLC含量測定方法[11]，對桑白皮中桑辛素的HPLC含量測定方法[12]，同時對桑白皮中桑根酮C、桑辛素等的HPLC含量測定方法[13]，但同時定量測定桑白皮中桑根酮C、桑根酮D及桑辛素的方法還未見報道。由于在制備桑白皮提取物的過程中，需對其質(zhì)量進(jìn)行控制和評價，為了節(jié)約分析時間和分析成本，急需建立一種同時測定三個成分的快速簡便和定量方法。因此，本研究將建立同時測定桑白皮提取物中桑根酮C、桑根酮D及桑辛素三種成分的HPLC含量測定方法，為桑白皮提取物的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 實驗材料

Agilent 1200高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；DZG-6050型真空干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司)；Ohaus Discovery DV215CD 型電子天平(奧豪斯公司)； UPS-II-20L型優(yōu)普系列超純水器(四川優(yōu)普超純科技有限公司)；BUG25-13型超聲波清洗器(美國BRANSON公司)。

桑白皮提取物由成都中醫(yī)藥大學(xué)養(yǎng)生保健科技有限公司提供，桑根酮C(批號：110831-201705，含量：99.8%)，桑根酮D(批號：110753-201815，含量：99.8%)，桑辛素(批號：110749-201717，含量：99.8%)對照品均購自成都普思生物科技股份有限公司。試驗中所用試劑，除乙腈為色譜純外，其他均為分析純。3個指標(biāo)性成分的結(jié)構(gòu)式見圖1。

注：M1.桑根酮C；M2.桑根酮D；M3.桑辛素

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為InterSustain AQ-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動相為：乙腈(A)-0.1%醋酸水(B)，梯度洗脫(0 ～ 20 min，45% ～ 70% A；20～26 min，70%～86% A)，波長276 nm；柱溫30 ℃；流速1 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL。見表1。對照品以及樣品色譜見圖2。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.2 樣品的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取桑辛素對照品適量，加無水乙醇配置成0.105 0 mg/mL的對照品儲備液，精密稱取桑根酮C、桑根酮D對照品適量，用色譜甲醇配置成0.990 0 mg/mL的桑根酮C、0.114 4 mg/mL的桑根酮D對照品儲備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 (1)超聲時間考察。精密稱定0.6 g桑白皮提取物5份，置具塞錐形瓶中，平行稱取3份，加入甲醇25 mL，稱定重量，分別超聲提取20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。稀釋后取10 μL注入高效液相色譜儀測定，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，隨提取時間的增加，三個成分含量先增加后降低，當(dāng)提取時間為30 min時，3個成分提取率最高，因此，最終選擇30 min為提取時間。測定結(jié)果見圖3。

(2)提取溶劑量的考察。精密稱定0.6 g桑白皮提取物5份，置具塞錐形瓶中，平行稱取3份，分別加入甲醇25 mL、50 mL、75 mL、100 mL、125 mL，稱定重量，超聲提取30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。稀釋后取10 μL注入高效液相色譜儀測定，觀察發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取溶劑體積為50 mL時，3個成分提取率最高，因此，最終選擇50 mL為提取溶劑體積。測定結(jié)果見圖4。

注：A.對照品；B.樣品。1.桑根酮C；2.桑根酮D；3.桑辛素

圖3 超聲時間的考察

圖4 提取溶劑量的考察

(3)供試品溶液的制備方法。綜上所述，供試品溶液的制備方法為：精密稱定桑白皮0.6 g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，超聲30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，稀釋8倍，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取桑根酮C對照品儲備液180 μL、桑根酮D對照品儲備液780 μL、桑辛素對照品儲備液230 μL，置于2 mL的棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，得到濃度為0.089 1、0.044 6、0.012 1 mg/mL的混合對照品儲備液。將混合對照品儲備液按“2.1”項下色譜條件測定，以2.5、5、10、15、20 μL分別進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對照品質(zhì)量為橫坐標(biāo)(X)，繪制3種成分的回歸曲線，線性方程和范圍見表2。

表2 桑根酮C、桑根酮D、桑辛素線性回歸方程

2.3.2 精密度試驗 精密吸取同一混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行高效液相色譜分析，測得桑根酮C、桑根酮D、桑辛素峰面積，計算桑根酮C峰面積的RSD為0.85%、桑根酮D峰面積的RSD為1.13%、桑辛素峰面積的RSD為0.86%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批桑白皮提取物6份，按“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制備樣品，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行分析測定，得桑根酮C、桑根酮D、桑辛素的含量分別為6.64%、3.19%、0.95%，計算出RSD值分別為1.78%、1.35%、3.28%，表明所用方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 精密稱取桑白皮提取物，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”項下色譜條件進(jìn)行HPLC分析，測得桑根酮C、桑根酮D、桑辛素峰面積，計算桑根酮C、桑根酮D、桑辛素峰RSD值分別為0.62%、1.32%、0.60%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的桑白皮提取物0.3 g，平行稱取6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入適量桑根酮C、桑根酮D和桑辛素對照品溶液，按“2.2.2”項下供試品溶液的制備方法制備樣品，以“2.1”項下色譜條件進(jìn)行HPLC分析，并計算被測各成分的回收率及RSD。桑根酮C、桑根酮D、桑辛素的平均加樣回收率分別為96.87%、101.02%、101.27%，RSD分別為1.90%、2.48%、1.74%，表明所用方法準(zhǔn)確度良好。見表3。

2.3.6 樣品測定 由于目前成都中醫(yī)藥大學(xué)養(yǎng)生保健科技有限公司生產(chǎn)制備的批次較少，僅從生產(chǎn)企業(yè)收集到3批樣品。按照上述方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。

表4 桑白皮提取物中3種成分的測定結(jié)果 (%)

3 討論

本研究綜合相關(guān)文獻(xiàn)報道和待測化合物紫外吸收的特征，最終確定檢查波長為276 nm；對比考察了超聲和加熱回流提取，發(fā)現(xiàn)兩種提取方式提取效果相似，但超聲提取更節(jié)約時間，因此選擇超聲提取方法；對比考察了不同的提取溶劑、提取時間、提取體積，最終建立了HPLC法同時測定桑白皮提取物中桑根酮C、桑根酮D、桑辛素3種有效成分的含量。此方法簡單、快速，各組分分離度均良好，方法精密度高、穩(wěn)定性好。采用此方法對3個批次的桑白皮提取物進(jìn)行分析，由表4結(jié)果可知，成都中醫(yī)藥大學(xué)養(yǎng)生保健科技有限公司制備的桑白皮提取物質(zhì)量較為一致，制備方法穩(wěn)定可靠。