復(fù)方扶芳藤合劑對(duì)D-半乳糖聯(lián)合AlCl3所致癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶改善作用研究

包傳紅,農(nóng)汝楠，孫 健，韋仁安，吳燕春*

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530200)

阿爾茨海默病(AD)又名老年性癡呆，作為一種慢性神經(jīng)退行性疾病，AD患者在行為上表現(xiàn)出認(rèn)知困難、學(xué)習(xí)記憶能力減退等。復(fù)方扶芳藤合劑(FFH)又名百年樂(lè)，由紅參、扶芳藤、黃芪組成，具有益氣補(bǔ)血、健脾養(yǎng)心、活血化瘀的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明FFH具有抗氧化、提高免疫力[1]及抗衰老作用[2]。臨床用FFH治療慢性疲勞綜合征[3]及防治老年血管性癡呆，增強(qiáng)記憶力[4]。目前AD病因及發(fā)病機(jī)制不明，但氧化應(yīng)激及膽堿能神經(jīng)的退化是導(dǎo)致AD發(fā)病的重要因素。因此本研究從抗氧化應(yīng)激及膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)機(jī)制驗(yàn)證FFH對(duì)D-半乳糖和AlCl3所致癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響，為FFH治療AD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 60只SPF級(jí)昆明種小鼠，體重(20±2)g，雌雄各半。由廣西醫(yī)科大學(xué)提供(許可證號(hào)：SCXK：桂2014-0003)。

1.1.2 藥品和試劑 復(fù)方扶芳藤合劑(廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠)；石杉?jí)A甲(辰欣藥業(yè)股份有限公司)；D-半乳糖(Solarbio)；AlCl3(上海豪申化學(xué)試劑有限公司)；SOD、GSH-PX及ChAT試劑盒(武漢華美工程公司)；MDA、Ach及AchE酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.1.3 儀器 Morris水迷宮設(shè)備全套(成都泰盟生產(chǎn))；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo scientific公司，型號(hào)：Multiskan MK)；臺(tái)式高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo scientific公司，型號(hào)：ST16)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與給藥 將昆明種60只小鼠分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、石杉?jí)A甲組和復(fù)方扶芳藤合劑高劑量組(9 g·kg-1)、中劑量組(4.5 g·kg-1)、低劑量組(2.25 g·kg-1)，每組10只。正常對(duì)照組腹腔注射生理鹽水，模型對(duì)照組和各給藥組腹腔注射D-半乳糖90 mg·kg-1及灌胃AlCl340 mg·kg-1，連續(xù)90 d[5]。造模成功后，分別給予石杉?jí)A甲及復(fù)方扶芳藤合劑，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌胃給予生理鹽水，20 mL·kg-1，每天1次，連續(xù)30 天。

1.2.2 Morris水迷宮檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)時(shí)間為6天，分為兩個(gè)階段：定位航行和空間探索。水迷宮實(shí)驗(yàn)第1天，撤除平臺(tái)，讓實(shí)驗(yàn)各組小鼠在水池中自由游泳2 min，第2天則為定位航行階段，總共5天，將小鼠面向池壁由4個(gè)入水點(diǎn)放入次池中，檢測(cè)小鼠在60 s內(nèi)成功進(jìn)駐平臺(tái)需要的時(shí)間(即逃避潛伏期)。最后一天進(jìn)行空間搜索實(shí)驗(yàn)，撤除平臺(tái)，讓小鼠在水池中自由游泳，記錄其尋求次數(shù)及停留時(shí)間(站臺(tái)直徑2倍范圍)。

1.2.3 小鼠腦組織SOD、GSH-PX、MDA、ChAT、Ach及AchE含量測(cè)定 水迷宮實(shí)驗(yàn)后，摘眼球采血后置于冰上取腦，用冷的生理鹽水溶液沖洗殘血，在濾紙上拭干。稱取腦組織后剪碎，置組織勻漿器中，加入9倍生理鹽水溶液，制備成10%組織勻漿，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，采用化學(xué)法測(cè)定小鼠腦組織MDA、Ach及AchE含量；ELISA法檢測(cè)小鼠腦組織SOD、GSH-PX及ChAT含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(ANOVA)，各組之間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)經(jīng)秩轉(zhuǎn)換后進(jìn)行兩兩比較。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠Morris水迷宮行為5天的潛伏期變化結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，從第1天到第5天正常對(duì)照組與模型對(duì)照組對(duì)比有差異(P<0.05或P<0.01)，與模型對(duì)照組比較，復(fù)方扶芳藤合劑高劑量組從第3天開(kāi)始到第5天的逃避潛伏期存在差異(P<0.05或P<0.01)。中劑量第5天的逃避潛伏期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低劑量有趨勢(shì)，但比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05。結(jié)果見(jiàn)表1。

組別第1天第2天第3天第4天第5天正常對(duì)照組50.28±10.24?41.11±9.83?33.43±12.36?25.22±10.36??18.28±8.73??模型對(duì)照組55.65±10.0150.21±11.2147.06±14.2643.28±13.3835.32±12.08石杉?jí)A甲組55.10±7.8246.33±8.7539.03±12.86?31.28±10.66??24.32±8.33??復(fù)方扶芳藤合劑高劑量組55.36±9.3546.58±9.4841.03±12.34?33.48±11.04??26.08±9.06??復(fù)方扶芳藤合劑中劑量組55.54±9.7847.98±9.6741.92±13.5336.48±11.9827.86±10.89?復(fù)方扶芳藤合劑低劑量組55.66±9.9347.88±9.5942.43±13.1337.12±12.0633.36±12.32

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 復(fù)方扶芳藤合劑對(duì)癡呆小鼠尋求次數(shù)及停留時(shí)間的影響

①尋求次數(shù)：各組尋求次數(shù)相對(duì)模型對(duì)照組明顯增多，與模型對(duì)照組比較，復(fù)方扶芳藤合劑高劑量及中劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，低劑量有趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；②停留時(shí)間：各組停留時(shí)間相對(duì)模型對(duì)照組都延長(zhǎng)，與模型對(duì)照組比較，復(fù)方扶芳藤合劑高劑量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，中劑量及低劑量有趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

組別劑量(g/kg)尋求次數(shù)(F)停留時(shí)間(s) 正常對(duì)照組- 11.60±2.76?? 18.03±3.32?? 模型對(duì)照組-7.10±1.1911.02±1.27 石杉?jí)A甲組0.01810.20±1.87?? 14.87±2.01??復(fù)方扶芳藤合劑高劑量組9 9.70 ±1.56??13.94±2.25??復(fù)方扶芳藤合劑中劑量組4.58.70±1.34?12.49±1.75復(fù)方扶芳藤合劑低劑量組2.257.90±1.2911.65±1.49

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 復(fù)方扶芳藤合劑對(duì)癡呆小鼠腦組織SOD、GSH-PX、MDA含量的影響

①SOD：與模型對(duì)照組比較，正常對(duì)照組、石杉?jí)A甲組和FFH高、中劑量組的SOD含量明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而FFH低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。②GSH-PX：與模型對(duì)照組比較，正常對(duì)照組、石杉?jí)A甲組、FFH高劑量組GSH-PX含量明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，F(xiàn)FH中劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；③與模型對(duì)照組比較，復(fù)方扶芳藤合劑高劑量組MDA水平明顯降低，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，中劑量組與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

組別給藥劑量(g/kg)SOD(μg·mL-1)GSH-PX(μg·mL-1)MDA(U/mol)正常對(duì)照組—169.5±19.32??132.3±8.64??21.34±3.45??模型對(duì)照組—88.48±11.3371.11±7.8356.46±6.32石杉?jí)A甲組0.018141.9±12.98??110.3±7.78??34.77±4.43??復(fù)方扶芳藤合劑高劑量組9129.3±11.21??98.33±9.09??39.21±4.59??復(fù)方扶芳藤合劑中劑量組4.5112.6±11.22?87.41±8.33?44.61±5.56?復(fù)方扶芳藤合劑低劑量組2.2594.56±9.8883.55±7.45?52.36±6.34

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 復(fù)方扶芳藤合劑對(duì)癡呆小鼠腦內(nèi)Ach、AchE酶及ChAT酶含量的影響

①與模型對(duì)照組比較，復(fù)方扶芳藤合劑高劑量組Ach活性明顯升高(P<0.01)，中劑量組也增高(P<0.05)；②與模型對(duì)照組比較，復(fù)方扶芳藤合劑高劑量組AchE酶含量明顯降低(P<0.01)，中劑量組AchE酶含量降低(P<0.05)；③ChAT含量：與模型對(duì)照組比較，復(fù)方扶芳藤合劑高劑量組及中劑量組ChAT含量均明顯增高(P<0.01)，低劑量組也升高(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表4。

組別給藥劑量(g/kg)Ach(μg·mg/prot)AchE酶(U·mg/prot)ChAT酶(μg·mL-1)正常對(duì)照組—118.7±13.01??0.45±0.08??133.6±15.46??模型對(duì)照組—70.23±8.251.19±0.1380.22±8.55石杉?jí)A甲組0.018102.5±10.22??0.68±0.09?118.3±13.88??復(fù)方扶芳藤合劑高劑量組994.63±9.33??0.76±0.11??108.6±13.01??復(fù)方扶芳藤合劑中劑量組4.586.65±9.11?0.97±0.16?102.3±11.04??復(fù)方扶芳藤合劑低劑量組2.2576.55±8.651.05±0.1693.55±9.22?

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為AD的產(chǎn)生主要與腎精虧虛、氣血不足、瘀血內(nèi)阻、痰濁壅盛等有關(guān)。復(fù)方扶芳藤合劑由紅參、扶芳藤、黃芪組成，能益氣補(bǔ)血、健脾養(yǎng)心、活血化瘀，符合中醫(yī)治療AD的理論。AD患者在行為上表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶能力減退，因此本實(shí)驗(yàn)用D-半乳糖聯(lián)合A1C13造成小鼠學(xué)習(xí)障礙后，采用Morris水迷宮檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)果表明給予復(fù)方扶芳藤合劑后小鼠在逃避潛伏期明顯降低，尋求次數(shù)增多，停留時(shí)間延長(zhǎng)。

自由基損傷學(xué)說(shuō)是AD的重要發(fā)病機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)采用D-半乳糖聯(lián)合A1C13造模，是因?yàn)镈-半乳糖代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生活性氧或自由基，過(guò)量的活性氧或自由基引起神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷，造成機(jī)體學(xué)習(xí)記憶能力下降[5]，而鋁是一種慢性蓄積性神經(jīng)毒素，A1C13毒性可損害膜結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化[6]，所以D-半乳糖聯(lián)合A1C13可引起和促進(jìn)AD的發(fā)生、發(fā)展。

自由基損傷后會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞老化、死亡。在機(jī)體自由基代謝過(guò)程中，SOD能將過(guò)氧化物自由基轉(zhuǎn)變成H2O2，后者在GSH-PX或過(guò)氧化脂質(zhì)分解時(shí)可產(chǎn)生丙二醛(MDA)等醛類，形成脂褐素，沉積于腦導(dǎo)致認(rèn)知障礙[7，8]。因此SOD及GSH-PX的活性能在一定程度上反映機(jī)體的自由基清除能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明復(fù)方扶芳藤合劑能顯著升高SOD、GSH-PX含量，降低MDA含量。

膽堿能損傷學(xué)說(shuō)是目前公認(rèn)的AD發(fā)病機(jī)制。大腦學(xué)習(xí)記憶能力與膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)有密切關(guān)系，乙酰膽堿是膽堿能神經(jīng)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，其由乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(CHAT)催化合成，釋放后作用于M受體，產(chǎn)生作用后，又被乙酰膽堿酯酶(AchE)催化分解成膽堿和乙酸，從而保持一種動(dòng)態(tài)平衡，使認(rèn)知功能正常發(fā)揮。因此ChAT和AchE共同作用調(diào)節(jié)Ach的動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)Ach合成及代謝途徑具有重要意義[9]。在發(fā)生AD時(shí)，基底前腦的膽堿能神經(jīng)元丟失，造成乙酰膽堿的合成、儲(chǔ)存、釋放減少，AchE降低[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)方扶芳藤合劑能顯著提高ChAT酶的含量，降低AchE的含量，使其生成的Ach 含量增多。

綜上所述，復(fù)方扶芳藤合劑可顯著升高SOD、GSH-PX、Ach及ChAT含量，降低MDA及AchE酶含量。復(fù)方扶芳藤合劑具有改善癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用，可能與其抗氧化作用及影響膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)有關(guān)。