間作小麥和接種AM真菌協(xié)同提高蠶豆抗枯萎病能力和根際微生物碳代謝活性

董 艷，趙 騫，呂家興，董 坤

（1 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，昆明 650201；2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201）

隨著農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化水平的提高，以高投入及高產(chǎn)出、種植品種單一、復(fù)種指數(shù)高和大量施肥和施藥等為特點(diǎn)的集約化種植已成為我國重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)模式[1]。由于對(duì)作物土傳病原微生物生長繁殖規(guī)律和傳播擴(kuò)散途徑的認(rèn)識(shí)不足，隨著集約化種植不斷推廣與發(fā)展，作物土傳病害在我國呈蔓延趨勢(shì)[1]。蠶豆(Vcia faba L.) 是世界溫帶和亞熱帶地區(qū)一種重要的食用豆類作物，在中國的栽培歷史超過2100年[2]。近年來隨著蠶豆生產(chǎn)的不斷發(fā)展，加之種植習(xí)慣和環(huán)境條件等原因，蠶豆連作現(xiàn)象日益普遍，造成土傳枯萎病普遍發(fā)生[3]?？菸∈窃颇鲜⌒Q豆生產(chǎn)上的重要病害，在蠶豆整個(gè)生育期都有發(fā)生，發(fā)生流行時(shí)間長，發(fā)病規(guī)律復(fù)雜，一旦發(fā)生較難防治，目前已經(jīng)成為限制蠶豆高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要因素之一[4]。

生產(chǎn)上控制土傳枯萎病的方法有土壤高溫消毒[5]、土壤厭氧消毒[6]、施用生物有機(jī)肥[7]、抗性育種和化學(xué)農(nóng)藥施用[8]等措施，這些措施均主要是降低土壤中病原菌的數(shù)量，可在不同程度上減輕枯萎病，但傳統(tǒng)的單一防治方式均有一定的局限性，不能及時(shí)有效地改善連作狀況[8]，而且化學(xué)防治還會(huì)導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等問題。在土壤生態(tài)系統(tǒng)中，有些微生物在抑制土傳病原物、促進(jìn)作物健康生長方面具有重要作用，如叢枝菌根 (arbuscular mycorrhizal，AM) 真菌正是這樣的生防菌[9]。AM真菌能夠拮抗由真菌、線蟲、細(xì)菌等病原體引起的土傳性植物病害，誘導(dǎo)宿主植物增強(qiáng)對(duì)病蟲害的耐/抗病性。當(dāng)前，利用AM真菌開展病蟲害的生物防治已經(jīng)引起生態(tài)學(xué)家和植物病理學(xué)家的廣泛關(guān)注[10]。例如，接種集球囊霉 (Glomus fasciculatum) 降低了仙客來枯萎病和炭疽病的發(fā)病率和病情指數(shù)[11]，接種聚叢球囊霉 (Glomus aggregatum) 降低了香蕉枯萎病的危害[12]。但這些研究均是在單作條件下開展的，有關(guān)間作系統(tǒng)接種AM真菌對(duì)土傳病害的影響尚不清楚。

作物根部土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)及其組成變化能反映土壤生態(tài)現(xiàn)狀及變化趨勢(shì)，對(duì)作物健康十分重要[13]。單一作物持續(xù)連作條件下，土壤中微生物多樣性降低，根際生態(tài)平衡被打亂，根際有害微生物在酸性條件下大量繁殖，土壤由“細(xì)菌型”轉(zhuǎn)變成“真菌型”，由“健康型”轉(zhuǎn)變成“致病型”，土壤微生物整體代謝活性降低[14]。因此提高根際微生物活性并改善其群落結(jié)構(gòu)有助于提高土壤健康程度，增加對(duì)土傳病害的抑制能力。接種幼套球囊霉(Glomus etunicatum) 顯著提高西瓜根際微生物數(shù)量并降低尖孢鐮刀菌和真菌數(shù)量，最終降低西瓜枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)[15]。土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)與地上作物組成密切相關(guān)，間作系統(tǒng)中由于種植兩種以上的作物 (或品種)，不同作物的根系分泌物組成不同，從而引起土壤微生物多樣性的變化，已經(jīng)成為緩解作物連作障礙的有效措施[16]。我們的前期研究表明，小麥與蠶豆間作控制蠶豆枯萎病與根際微生物活性和群落結(jié)構(gòu)變化有關(guān)[17-18]，但有關(guān)該間作系統(tǒng)中接種AM真菌對(duì)蠶豆根際微生物代謝功能多樣性的影響及其與枯萎病發(fā)生的關(guān)系尚不清楚。因此，本研究以小麥與蠶豆間作體系為對(duì)象，研究蠶豆枯萎病發(fā)生、鐮刀菌數(shù)量和根際微生物代謝功能多樣性對(duì)接種AM真菌的響應(yīng)，明確間作及AM真菌協(xié)同控制枯萎病的微生物學(xué)機(jī)制，為土傳病害防控提供有效、安全、環(huán)境友好的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試蠶豆品種為89-147(Vicia faba L. cv. 89-147)，小麥品種為云麥53(Tricumaestivum L.cv.Yunmai 53)，均來自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。

供試病原菌尖孢鐮刀菌蠶豆?；?Fusarium oxysporum f. fabae(FOF) 的分離和培養(yǎng)參照董艷等[17]的方法進(jìn)行分離和培養(yǎng)。

供試土壤為連作蠶豆11年的土壤，采集于云南省安寧市祿脿鎮(zhèn)上村。土壤有機(jī)質(zhì)含量14.7 g/kg、氮1.25 g/kg、堿解氮62.9 mg/kg、速效磷35.2 mg/kg、速效鉀 61.3 mg/kg、pH 7.02。供試菌種為 摩西管柄囊霉Funneliformis mossea (BGCGZ01A，記為Fm) 和扭形球囊霉Glomus tortuosum (BGCNM03A，記為Gt)，均購自北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源研究所[17]。接種菌根菌劑以玉米和苜蓿為宿主植物進(jìn)行擴(kuò)繁，每10 g菌劑含有700個(gè)孢子。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)2種種植模式和3種AM真菌接種方式，共6個(gè)處理 (所有處理均接種FOF)，即：1）MF，蠶豆單作 (對(duì)照)；2） IF，蠶豆與小麥間作；3）MFFm，單作接種Fm；4）IFFm，間作接種Fm；5）MFGt，單作接種Gt；6）IFGt，間作接種Gt。每個(gè)處理3次重復(fù)，共計(jì)18盆。

土培盆栽試驗(yàn)于2012年10月至2013年2月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室中進(jìn)行。將AM真菌和1.8 g滅菌土混合均勻后裝入塑料盆中，2種AM真菌的接種量均為54 g，不接菌的處理，接入54 g滅菌的AM菌劑以維持與其他處理間的微生物平衡。為保證蠶豆的正常生長，蠶豆播種前以基肥的形式施入N(尿素) 75 mg/kg、P2O5(普鈣) 100 mg/kg、K2O(硫酸鉀)100 mg/kg。

蠶豆種子用10%的H2O2進(jìn)行30 min消毒后，用滅菌水沖洗干凈后將種子轉(zhuǎn)移到25℃下恒溫催芽，蠶豆發(fā)芽后播種至塑料盆中，覆蓋0.2 kg經(jīng)高壓蒸汽滅菌的土壤。蠶豆單作處理每盆播種蠶豆6株，間作處理每盆播種蠶豆3株、小麥12株，試驗(yàn)為隨機(jī)排列。生長期間每隔2 天用稱重法補(bǔ)充去離子水，水分保持在田間最大持水量的75%左右，光照時(shí)間為12 h/d，期間不進(jìn)行任何農(nóng)藥處理。待蠶豆長至3葉期時(shí)，采用傷根法接種，尖孢鐮刀菌孢子懸浮液濃度為4 × 105cfu/mL，接種量為15 mL。

1.3 蠶豆枯萎病調(diào)查

按董艷等[17-18]的5級(jí)分類法進(jìn)行枯萎病調(diào)查，每個(gè)重復(fù)調(diào)查3株蠶豆，調(diào)查完成后計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。

1.4 根際鐮刀菌數(shù)量和微生物代謝功能多樣性測(cè)定

蠶豆播種后70 d進(jìn)行采樣，將采集的根際土壤置于4℃保存，一周內(nèi)完成鐮刀菌數(shù)量和微生物代謝功能多樣性測(cè)定。尖孢鐮刀菌計(jì)數(shù)參照Booth[19]的方法采用PCNB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。土壤微生物代謝功能多樣性采用Biolog ECO板 (ECO MicroPlate，美國) 進(jìn)行測(cè)定，具體操作參照董艷等[17-18]方法進(jìn)行。

1.5 計(jì)算公式與統(tǒng)計(jì)分析

土壤微生物碳源代謝活性用平均微孔顏色吸光值 (average well color development，AWCD) 來描述[17-18]，計(jì)算公式如下：

式中，Ci為第i種碳源的吸光度值；R為對(duì)照孔的吸光度值；31為碳源的數(shù)目。

用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)來描述微生物群落代謝多樣性[17-18]，計(jì)算公式如下：

式中，Pi為第i孔的相對(duì)吸光值與整個(gè)微平板的相對(duì)吸光值總和的比值。

群落豐富度指數(shù) (S) 用碳源代謝孔的數(shù)目表示[17-18]。

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SAS 8.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、主成分分析和相關(guān)分析 (大小采用Pearson指數(shù))，差異顯著性采用最小顯著差異法 (LSD) 進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 間作和接菌對(duì)AM真菌侵染、蠶豆枯萎病發(fā)生和幼苗生長的影響

2.1.1 間作和接菌對(duì)AM真菌侵染率的影響 不接菌條件下，蠶豆和小麥根系均無AM真菌侵染；單作條件下，接種Fm對(duì)蠶豆根系的侵染率比Gt高18.4%；間作條件下，F(xiàn)m對(duì)蠶豆、小麥根系的侵染率比Gt分別高24.5%和30.7%。接種同種AM真菌條件下，間作系統(tǒng)蠶豆根系的AM真菌侵染率均顯著高于單作，其中Fm、Gt分別比單作系統(tǒng)高20.9%和 19.0% (表 1)。

2.1.2 間作和接菌對(duì)根際鐮刀菌數(shù)量及蠶豆枯萎病發(fā)生的影響 與不接菌的單作處理 (MF) 相比，間作(IF) 和接菌 (MFFm、MFGt) 均顯著降低了蠶豆根際的鐮刀菌數(shù)量，其中IF處理顯著降低63.9%，而MFFm和MFGt處理顯著降低95.2%和74.3%。與間作蠶豆 (IF) 相比，接菌 (IFFm、IFGt) 的蠶豆根際鐮刀菌數(shù)量顯著降低96.2%和65.9%，以IFFm處理的效果最好。接菌條件下，間作處理 (IFFm、IFGt) 蠶豆根際鐮刀菌數(shù)量均低于相應(yīng)的單作處理 (MFFm、MFGt) (表 2)。

與單作 (MF) 相比，間作 (IF) 降低蠶豆枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)20.0%和71.4%；接種Fm、Gt顯著降低發(fā)病率70.0%和50.0%，顯著降低病情指數(shù)93.9%和59.2%。表明小麥與蠶豆間作和接種菌根均抑制了蠶豆枯萎病的發(fā)生與發(fā)展，尤其以接種Fm真菌的效果最好 (表2)。與MF處理相比，間作接菌處理 (IFFm、IFGt) 的蠶豆枯萎病發(fā)病率降低100%和40.0%；病情指數(shù)降低100%和79.6%。表明小麥與蠶豆間作接菌具有協(xié)同降低蠶豆枯萎病的作用，以間作接種Fm的效果最好 (表2)。

2.1.3 間作和接菌對(duì)蠶豆和小麥幼苗干重的影響如圖1所示，與單作相比，間作分別顯著提高蠶豆地下部和地上部干重100%和83.7%；接種Fm真菌顯著提高蠶豆地下部和地上部干重90.6%和44.3%，接種Gt真菌顯著提高蠶豆地下部和地上部干重68.3%和25.3%。表明間作和接種AM真菌均促進(jìn)了蠶豆的生長。

表1 AM真菌蠶豆小麥侵染率 (%)Table 1 AM fungal colonization rate on faba bean and wheat

表2 間作及接種AM真菌處理下蠶豆根際鐮刀菌數(shù)量、枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)Table 2 Fusarium oxysporum density in rhizosphere soil incidence and index of faba bean Fusarium wilt under treatments of intercropping and inoculation of AM fungi

圖1 間作和接菌處理蠶豆幼苗、小麥干重Fig. 1 Dry weight of faba bean seedlings and wheat under treatments of intercropping and inoculation of AM fungi[注（Note）：MF—單作接種尖孢鐮刀菌Monocropping and inoculation with FOF；IF—間作接種尖孢鐮刀菌Intercropping and inoculation with FOF；MFFm—單作接種摩西管柄囊霉和尖孢鐮刀菌Monocropping and inoculation with F. mosseae and FOF；IFFm—間作接種摩西管柄囊霉和尖孢鐮刀菌Intercropping and inoculation with F. mosseae and FOF；MFGt—單作接種扭形球囊霉和尖孢鐮刀菌Monocropping and inoculation with G. tortuosum and FOF；IFGt—間作接種扭形球囊霉和尖孢鐮刀菌Intercropping and inoculation with G. tortuosum and FOF；柱上不同字母分別表示蠶地下部或地上部處理間差異顯著Different letters above the bars indicate significantly different among treatments in shoots or roots (P ＜ 0.05).]

與MF相比，間作接菌處理 (IFFm、IFGt) 顯著增加蠶豆幼苗地下部干重155%和109%，顯著增加地上部干重72.0%和58.0%。IFFm、IFGt分別提高小麥地上部干重77.5%和64.5%，但降低地下部干重48.2%和54.4%。表明間作配合接種AM真菌顯著促進(jìn)蠶豆幼苗地上部和地下部的生長，其中以接種Fm條件下蠶豆幼苗地上部和地下部干重最大，但對(duì)于小麥的效應(yīng)存在差異，接種Fm和Gt真菌促進(jìn)地上部生長，但使小麥地下部生長受阻。

2.2 間作和接菌對(duì)蠶豆根際微生物碳代謝活性的影響

2.2.1 蠶豆根際微生物碳源利用平均顏色變化率(AWCD) 如圖2所示，各處理的AWCD值隨培養(yǎng)時(shí)間延長而上升，尤其是培養(yǎng)48 h后急劇增加。培養(yǎng)72 h時(shí)，與MF相比，間作接菌處理 (IFFm和IFGt) 的AWCD提高111.0%和133.0%。

圖2 不同處理下根際微生物碳源利用平均顏色變化率(AWCD)Fig. 2 AWCD of faba bean rhizosphere soil in different treatments[注（Note）：MF—單作接種尖孢鐮刀菌Monocropping and inoculation with FOF；IF—間作接種尖孢鐮刀菌Intercropping and inoculation with FOF；MFFm—單作接種摩西管柄囊霉和尖孢鐮刀菌Monocropping and inoculation with F. mosseae and FOF；IFFm—間作接種摩西管柄囊霉和尖孢鐮刀菌Intercropping and inoculation with F. mosseae and FOF；MFGt—單作接種扭形球囊霉和尖孢鐮刀菌Monocropping and inoculation with G. tortuosum and FOF；IFGt—間作接種扭形球囊霉和尖孢鐮刀菌Intercropping and inoculation with G. tortuosum and FOF.]

2.2.2 蠶豆根際微生物碳源利用特征 從Biolog-ECO板的代謝指紋圖譜來看 (圖3)，蠶豆根際微生物利用6類碳源的能力依次為碳水化合物 (CH) ＞ 氨基酸類 (AA)、羧酸類 (CA) ＞ 聚合物 (PM) ＞ 胺類(AM) ＞ 酚酸類 (PA)。6類碳源對(duì)AM真菌均響應(yīng)敏感。與MF相比，接種Fm真菌處理 (MFFm) 使根際微生物對(duì)CH、AA、CA、PM、AM、PA類碳源的利用顯著提高73.2%、130%、27.5%、86.9%、728%和48.9%；接種Gt真菌處理 (MFGt) 使根際微生物對(duì)CH、AA、CA、PM類碳源利用顯著提高68.7%、114%、80.2%和130%。表明接種AM真菌處理 (MFFm、MFGt) 顯著提高了根際微生物對(duì)碳源的利用，其中以接種Fm真菌條件下效果較好 (圖3)。

與MF相比，IFFm處理使根際微生物對(duì)CH、AA、CA、PM、AM、PA類碳源的利用顯著提高63.6%、164%、51.8%、118%、1322%和125%；IFGt處理使根際微生物對(duì)CH、AA、CA、PM、AM、PA類碳源顯著提高112%、154%、68.5%、76.7%、816%和136%。表明間作條件下配合接種AM真菌能顯著提高蠶豆根際微生物對(duì)Biolog ECO板中六類碳源的利用。

2.2.3 間作和接菌對(duì)根際微生物多樣性指數(shù)的影響與MF相比，IF處理顯著提高微生物香農(nóng)多樣性指數(shù) (H) 4.3%，接種Fm和Gt真菌使H分別顯著提高7.6%和4.4%；間作接菌 (IFFm和IFGt) 使H顯著提高10.5%和10.5% (圖4)。與MF相比，IF處理顯著提高微生物豐富度指數(shù) (S)20.6%；接種Fm和Gt真菌使蠶豆根際微生物的豐富度指數(shù) (S) 顯著提高23.8%和20.6%；間作接菌 (IFFm和IFGt) 顯著提高S指數(shù)36.5%和41.3%。表明小麥與蠶豆間作并接種AM真菌均能顯著提高微生物的H和S。

圖3 不同處理對(duì)蠶豆根際微生物利用六類碳源的影響Fig. 3 Effect of different treatments on utilization of six types of carbon source[注（Note）：MF—單作接種尖孢鐮刀菌Monocropping and inoculation with FOF；IF—間作接種尖孢鐮刀菌Intercropping and inoculation with FOF；MFFm—單作接種摩西管柄囊霉和尖孢鐮刀菌Monocropping and inoculation with F. mosseae and FOF；IFFm—間作接種摩西管柄囊霉和尖孢鐮刀菌Intercropping and inoculation with F. mosseae and FOF；MFGt—單作接種扭形球囊霉和尖孢鐮刀菌Monocropping and inoculation with G. tortuosum and FOF；IFGt—間作接種扭形球囊霉和尖孢鐮刀菌Intercropping and inoculation with G. tortuosum and FOF；CH—碳水化合物類Carbohydrates；AA—氨基酸類Amino acids；CA—羧酸類Carboxylic acids；PM—聚合物Polymers；AM—胺類Amines /amides；PA—酚酸類Phenolic acids；柱上不同字母表示相同碳源下不同處理間差異顯著Different letters above the bars indicate significantly different among treatments with the same carbon source (P ＜ 0.05).]

圖4 不同處理對(duì)蠶豆根際微生物群落多樣性指數(shù)的影響Fig. 4 Effects of different treatments on microbial community diversity index of faba bean rhizosphere microbe[注（Note）：MF—單作接種尖孢鐮刀菌Monocropping and inoculation with FOF；IF—間作接種尖孢鐮刀菌Intercropping and inoculation with FOF；MFFm—單作接種摩西管柄囊霉和尖孢鐮刀菌Monocropping and inoculation with F. mosseae and FOF；IFFm—間作接種摩西管柄囊霉和尖孢鐮刀菌Intercropping and inoculation with F. mosseae and FOF；MFGt—單作接種扭形球囊霉和尖孢鐮刀菌Monocropping and inoculation with G. tortuosum and FOF；IFGt—間作接種扭形球囊霉和尖孢鐮刀菌Intercropping and inoculation with G. tortuosum and FOF；柱上不同字母表示處理間差異顯著Different letters above the bars indicate significantly different among treatments (P ＜ 0.05).]

2.2.4 根際微生物碳源利用特征的主成分分析 蠶豆單間作處理間根際微生物群落結(jié)構(gòu)在PC1上有較大分離。MFFm和MFGt處理與MF處理在PC1上有較好的分離，表明接菌明顯改變了蠶豆根際微生物的群落結(jié)構(gòu)，以接種Fm處理對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響大于接種Gt處理。間作接菌處理 (IFFm和IFGt) 與不接菌處理 (IF) 在PC1和PC2上均有明顯的分離，表明間作條件下接種菌根能明顯改變蠶豆根際微生物的群落結(jié)構(gòu) (圖5)。

從表3可看出，在PC1上相關(guān)系數(shù)較高的碳源有18種，其中碳水化合物類6種，氨基酸類2種、羧酸類5種、聚合物類3種、胺類1種和酚酸類1種。表明不接菌條件下的單間作處理 (MF與IF)、單作條件下不接菌和接菌處理 (即MF與MFFm、MFGt)、間作條件下接菌處理 (IFFm和IFGt) 與不接菌處理 (IF) 間微生物群落結(jié)構(gòu)的差異是由根際微生物利用以下碳源：碳水化合物類 (β-甲基-D-葡萄糖苷、D-半乳糖酸-γ-內(nèi)酯、D-甘露醇、D-纖維二糖、葡萄糖-1-磷酸鹽和α-D-乳糖)、氨基酸類 (L-精氨酸和L-苯丙氨酸)、羧酸類 (丙酮酸甲酯、γ-羥基丁酸、衣康酸、α-丁酮酸和D-蘋果酸)、聚合物類 (聚山梨醇酯40和α-環(huán)糊精)、胺類 (腐胺) 和酚酸類 (4-羥基苯甲酸) 的差異導(dǎo)致的，反映出碳水化合物類和羧酸類碳源是導(dǎo)致以上處理間微生物群落結(jié)構(gòu)變化的敏感碳源。

在PC2上相關(guān)系數(shù)較高的碳源有16種，其中碳水化合物類5種、氨基酸4種、羧酸類碳源4種、聚合物1種、胺類化合物1種和酚酸類1種。單作條件下MFFm和Gt處理間、MF與IFFm和IFGt處理間微生物群落結(jié)構(gòu)的差異是由根際微生物對(duì)以下碳源：糖類 (D，L-α-甘油磷酸鹽、D-木糖、N-乙?；?D-葡萄糖胺、D-纖維二糖、β-甲基-D-葡萄糖苷)、氨基酸類 (葡萄糖-L-谷氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸和L-天冬酰胺酸)、羧酸類 (丙酮酸甲酯、D-葡萄糖胺酸、衣康酸和α-丁酮酸)、聚合物類 (α-環(huán)糊精)、胺類 (苯基乙胺) 和酚酸類 (2-羥基苯甲酸) 的利用差異導(dǎo)致的。表明碳水化合物、氨基酸和羧酸類碳源是導(dǎo)致單作條件下Fm和Gt處理間及MF與IFFm和IFGt處理間微生物群落結(jié)構(gòu)差異的敏感碳源。

2.3 枯萎病發(fā)病率、病情指數(shù)與根際鐮刀菌數(shù)量、微生物碳代謝活性的相關(guān)分析

為明確蠶豆根際微生物碳代謝活性與蠶豆枯萎病發(fā)生的關(guān)系，將蠶豆根際土壤中尖孢鐮刀菌數(shù)量、微生物平均顏色變化率、Shannon多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)與枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果表明，蠶豆枯萎病的發(fā)病率與病情指數(shù)與根際鐮刀菌數(shù)量呈極顯著正相關(guān)，與根際微生物平均顏色變化率、Shannon多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系 (表4)。說明蠶豆枯萎病發(fā)生及嚴(yán)重程度與根際土壤微生物活性和多樣性密切相關(guān)，即蠶豆根際微生物碳代謝活性越低，根際鐮刀菌數(shù)量越多，枯萎病發(fā)生越嚴(yán)重。

3 討論與結(jié)論

3.1 間作系統(tǒng)接種AM真菌對(duì)枯萎病的抑制

圖5 不同處理?xiàng)l件下根際微生物碳源代謝主成分分析Fig. 5 Principal component analysis (PCA) of rhizosphere microbial community carbon source metabolism in different treatments[注（Note）：MF—單作接種尖孢鐮刀菌Monocropping and inoculation with FOF；IF—間作接種尖孢鐮刀菌Intercropping and inoculation with FOF；MFFm—單作接種摩西管柄囊霉和尖孢鐮刀菌Monocropping and inoculation with F. mosseae and FOF；IFFm—間作接種摩西管柄囊霉和尖孢鐮刀菌Intercropping and inoculation with F. mosseae and FOF；MFGt—單作接種扭形球囊霉和尖孢鐮刀菌Monocropping and inoculation with G. tortuosum and FOF；IFGt—間作接種扭形球囊霉和尖孢鐮刀菌Intercropping and inoculation with G. tortuosum and FOF.]

表3 31種碳源與PC1、PC2的相關(guān)系數(shù)Table 3 31 sole-carbon sources substrates with high Pearson’s correlation coefficients for PC1 and PC2 in the PCA of substrate utilization patterns of soil microbial community

近年來我國農(nóng)作物的土傳病害日趨嚴(yán)重，對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重影響，已成為限制我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要瓶頸[20]。接種摩西管柄囊霉 (F.mosseae) 的西瓜植株枯萎病病情指數(shù)降低89.3%[21]。番茄//韭蔥和番茄//紫蘇系統(tǒng)中，接菌比不接菌處理顯著降低番茄枯萎病病指70%和63%[22]。本研究中，與蠶豆單作不接菌處理 (MF) 相比，間作接菌處理 (IFFm、IFGt) 的蠶豆枯萎病發(fā)病率降低100%和40.0%；病情指數(shù)降低100.0%和79.6% (表2)，表明間作接菌是控制蠶豆枯萎病的有效措施，尤其在間作條件下配合接種Fm真菌對(duì)蠶豆枯萎病的控制效果最好。旱作水稻與西瓜間作系統(tǒng)接菌對(duì)西瓜枯萎病的研究中也觀察到相似的結(jié)果，即與不接菌的處理相比，接種幼套球囊霉 (Glomus etunicatum) 和根內(nèi)球囊霉 (Glomus intraradices) 處理的西瓜枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)明顯降低，防治效果分別為40.8%和29.7%[15]。

表4 蠶豆枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)與根際鐮刀菌數(shù)量、微生物碳代謝活性的相關(guān)分析Table 4 Correlation coefficients of disease incidence and disease index with rhizosphere microbial C metabolic activity and F. oxysporum density

3.2 間作系統(tǒng)接菌改變根際微生物代謝功能多樣性及其抑病功能

研究表明，連作導(dǎo)致土壤細(xì)菌種群數(shù)量下降，真菌種群數(shù)量上升，細(xì)菌與真菌數(shù)量比 (B/F) 大幅度降低，微生物代謝類群多樣性逐漸下降，土壤微生態(tài)平衡和健康受到威脅[23]。因此，研究具有改善土壤生態(tài)環(huán)境及克服連作土壤中微生物群落失衡引起的連作障礙的防治措施尤為重要。AM真菌對(duì)根際微生物區(qū)系、多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響是AM真菌抑制土傳病害的重要機(jī)制之一[24]。本研究結(jié)果表明，接種Fm和Gt真菌的蠶豆根際微生物活性 (AWCD值)顯著提高，最終降低了蠶豆枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)，同時(shí)促進(jìn)了蠶豆和小麥的生長。相關(guān)分析顯示，蠶豆枯萎病發(fā)病率和病情指數(shù)與根際微生物碳代謝活性和多樣性具有極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，原因可能是AM真菌與作物建立共生關(guān)系后，真菌菌絲的發(fā)育能夠促使植物分泌可以吸引土壤微生物的物質(zhì)，將其釋放到根際環(huán)境中，土壤微生物利用這些滲出物作為基質(zhì)，增加其活性和多樣性[25]。

在中國古代，人們就開始考慮利用間作種植提高土壤肥力，避免病害。最近的研究表明，合理間作種植能顯著增加根際微生物的活性與多樣性，抑制土傳病害發(fā)生[26]。本研究中間作蠶豆根際微生物活性高于單作蠶豆 (圖2)，原因是間作系統(tǒng)中由于地上部作物種類多樣性增加，凋落物的不斷積累，供給微生物利用的碳源種類和數(shù)量逐漸增加，同時(shí)也增加了根系分泌物的分泌速率，進(jìn)而提高了微生物活性，明顯改變了微生物群落結(jié)構(gòu)[27]。馬琨等[28]對(duì)蠶豆與馬鈴薯間作系統(tǒng)的研究表明，間作馬鈴薯根際微生物的平均顏色變化率 (AWCD值) 比對(duì)照 (單作馬鈴薯) 提高36.8%；間作并接種AM真菌 (G.etunicatum)后，馬鈴薯根際微生物平均顏色變化率比單作提高48.96%，同時(shí)提高馬鈴薯根際微生物群落功能多樣性，增強(qiáng)了以羧酸類、多聚化合物、芳香類化合物、氨基酸類化合物為碳源的微生物類群代謝活性。本研究中，間作接菌 (IFFm和IFGt) 條件下蠶豆根際微生物活性最高 (圖2)，原因可能是間作條件下接種AM真菌，其定殖能力比單作系統(tǒng)更強(qiáng)，間作系統(tǒng)AM真菌通過其在土壤中增殖而增加作物根系分泌物的種類和數(shù)量，最終增加根際微生物的活性并改善微生物群落結(jié)構(gòu)失調(diào)的狀況。如在番茄與黃瓜間作系統(tǒng)接種G. mosseae真菌時(shí)，番茄根系分泌糖的量顯著高于未接種AMF的處理[29]。

小麥與蠶豆間作系統(tǒng)接種AM真菌降低蠶豆枯萎病發(fā)生可能與根際微生物的“競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)”有關(guān)，如AM真菌與蠶豆共生后，其菌絲會(huì)迅速占據(jù)相應(yīng)的生態(tài)位，生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)主要包括侵染位點(diǎn)和營養(yǎng)能源兩個(gè)方面[9,30]。從侵染位點(diǎn)來看，AM真菌侵染宿主根系形成菌根后，其菌絲會(huì)迅速占據(jù)相應(yīng)的生態(tài)位點(diǎn)，從而減少病原物的侵染位點(diǎn)并降低其數(shù)量[9,30]。從營養(yǎng)能源來看，AM真菌和病原物的生長都依賴宿主植物提供能量和營養(yǎng)，當(dāng)來自蠶豆根系的光合產(chǎn)物首先被AM真菌利用時(shí)，鐮刀菌獲取的機(jī)會(huì)無疑會(huì)減少，從而限制鐮刀菌的生長和繁殖[9]。此外小麥//蠶豆并接種AM真菌增加根際微生物活性可能對(duì)蠶豆連作自毒物質(zhì)的降解具有重要的貢獻(xiàn)，可在一定程度上減輕自毒物質(zhì)對(duì)枯萎病菌的刺激而抑制鐮刀菌對(duì)蠶豆的侵染。表明間作系統(tǒng)接種AM真菌通過改善微生物群落結(jié)構(gòu)，提高微生物活性和多樣性而在蠶豆枯萎病控制中發(fā)揮著重要作用。

小麥與蠶豆間作系統(tǒng)接種AM真菌減輕蠶豆枯萎病的危害還可能與小麥與蠶豆間形成菌絲橋有關(guān)，由于菌絲橋形成而促進(jìn)小麥根系分泌物向蠶豆根際、根表和根內(nèi)運(yùn)輸，進(jìn)一步抑制蠶豆?；图怄哏牭毒谛Q豆根際的生長和繁殖，從而減輕了蠶豆枯萎病的危害[31]。在旱作水稻與西瓜間作體系接種AM真菌也觀察到水稻與西瓜間形成菌絲橋而抑制西瓜枯萎病的危害[21]。

接種AM真菌對(duì)土傳病害的防效與AM真菌種類有關(guān)，西瓜單作條件下接種幼套球囊霉 (G. etunicatum)對(duì)西瓜根際的西瓜?；图怄哏牭毒酗@著的抑制作用，可有效減輕西瓜枯萎病的發(fā)生，但接種根內(nèi)球囊霉 (G. intraradices) 對(duì)根際鐮刀菌、西瓜枯萎病的發(fā)病率和病情指數(shù)均無顯著影響[15]。本研究中，單作條件下接種Fm和Gt真菌對(duì)枯萎病的控制效果不同，以接種Fm真菌的效果較好，接種Fm真菌后蠶豆根際微生物對(duì)碳水化合物類、氨基酸類、胺類和酚酸類碳源的利用強(qiáng)度顯著高于Gt真菌處理，暗示了接種不同的AM真菌改變了寄主作物根系分泌物的組分和含量而造成對(duì)根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響不同，最終影響對(duì)病原真菌的抑制效果。小麥與蠶豆間作條件下接種AM真菌提高了蠶豆根際微生物對(duì)碳水化合物類、氨基酸類和羧酸類碳源的利用，改變根際微生物群落結(jié)構(gòu)可能是間作協(xié)同AM真菌減輕蠶豆枯萎病危害的重要機(jī)制之一。在間作系統(tǒng)中，AM真菌既能與病原物直接發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，又能通過宿主間接發(fā)揮抗病作用，且與間作抑病有一定的疊加效應(yīng)。目前有關(guān)AM真菌在間作系統(tǒng)抑病過程中所發(fā)揮作用的認(rèn)識(shí)十分匱乏，亟待開展系統(tǒng)研究[9]。