axin和METTL14在胃癌組織中的表達情況及其與患者臨床特征的關系

華勇，張秉麗，李有連

青海仁濟醫(yī)院消化科，西寧 810000

胃癌是中國較常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率居各種惡性腫瘤第5位，病死率居各種惡性腫瘤第4位[1]。其發(fā)病年齡一般在50歲，但近年來發(fā)現(xiàn)，胃癌的發(fā)病人群正趨于年輕化。胃癌的發(fā)病原因多樣，目前國內外的醫(yī)學工作者尚未明確其發(fā)病機制。胃癌發(fā)病隱匿，早期癥狀往往被患者誤認為是消化道潰瘍，且常見的計算機體層攝影（CT）、血常規(guī)等檢查方法較難發(fā)現(xiàn)，一旦發(fā)現(xiàn)往往處于晚期，喪失了手術治療的機會，給治療和康復帶來極大困難[2-3]。傳統(tǒng)治療胃癌的方法是手術、放療和化療。軸抑制劑（axis inhibitor，axin）是廣泛存在于生物體內的一種支架蛋白，是Wnt信號通路中非常重要的調控因子[4]。axin在惡性腫瘤細胞的分化、增殖和遷移過程中發(fā)揮重要作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，當axin基因表達出現(xiàn)異常時，會調節(jié)靶基因的表達，從而影響胃部細胞的正常生長，導致胃部惡性腫瘤的形成。已有研究報道，axin基因異常表達可促進肺癌、結腸癌等惡性腫瘤形成[5]。甲基轉移酶樣蛋白14（methyltransferase like 14，METTL14）是一種非常重要的甲基轉移酶，可調控mRNA水平，與腫瘤細胞的增殖、分化和凋亡密切相關[6]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，METTL14主要調控細胞的分化、增殖和凋亡，與胃癌的形成密切相關[7]。本研究分析胃癌組織、正常胃黏膜組織及癌前病變組織中axin與METTL14蛋白的表達情況，旨在為胃癌的診斷和治療提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年7月至2017年7月于青海仁濟醫(yī)院接受手術治療的胃癌患者。納入標準：①經病理檢查確診為胃癌；②入院前未接受過化療、放療等其他治療；③臨床資料完整。排除標準：①合并高血壓等慢性疾??；②合并心、肝、腎功能不全等疾??；③合并精神疾病。根據(jù)納入和排除標準，本研究共納入79例胃癌患者，作為觀察組。其中，男49例，女30例；年齡30～75歲；腫瘤部位：胃竇51例，胃體16例，胃底賁門12例；臨床分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期25例，Ⅲ期35例，Ⅳ期8例；淋巴結轉移30例，無淋巴結轉移49例。選擇同期于青海仁濟醫(yī)院進行胃鏡檢查確診為胃癌癌前病變的31例患者作為對照組，其中男22例，女9例；年齡29～76歲；病變類型：上皮內瘤變16例，腸上皮生化15例。兩組患者的性別、年齡、體重指數(shù)和病程比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1），具有可比性。收集胃癌患者的胃癌組織和正常胃黏膜組織（距腫瘤邊緣＞5 cm）標本各79例，收集癌前病變患者的癌前病變組織標本31例。

表1 兩組患者的臨床特征

1.2 免疫組織化學染色方法

采用免疫組織化學染色法檢測各組織中的axin和METTL14蛋白的表達情況：將采集的組織樣本切取厚度為0.3 cm左右的樣本塊，放入濃度為4%的多聚甲醛中，10 h后取出，蒸餾水清洗15 min，80%、90%、95%、100%的乙醇脫水，二甲苯透明2次，每次20 min，然后用57℃石蠟包埋，連續(xù)切取厚度為4μm的切片，置于載玻片上，漂烘儀中脫蠟30 min，然后使用100%乙醇脫去二甲苯，使用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗 3次。將蒸餾水和30%過氧化氫按照10∶1配制，將切片置于混合液中，10 min后取出，蒸餾水清洗3次，然后放入檸檬酸緩沖液中，加熱至100℃，15 min后冷卻至室溫，使用PBS沖洗3次，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）試劑盒A液封閉切片，10 min后棄去A液，加入兔抗人axin與METTL14多克隆抗體，對照則加入PBS緩沖液，4℃過夜，然后PBS沖洗3次，每次5 min，每張切片均滴加SP試劑盒B液，孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，滴加SP試劑盒C液，孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，滴加顯色液后對切片進行復染、透明、封片。

1.3 免疫組織化學染色結果判定標準

由本院2名具有10年以上經驗的病理科醫(yī)師采用雙盲法進行閱片。METTL14陽性顆粒呈黃色，主要定位于細胞核；axin陽性顆粒呈黃色，主要定位于細胞質，少量表達于細胞核。對每例標本隨機選取10個高倍（×400）視野，每個視野計數(shù)100個細胞。染色強度評分：無色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。陽性細胞所占百分比評分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。染色強度與陽性細胞所占百分比評分相加，≥2分為陽性，＜2分為陰性[7]。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；相關性分析采用Spearman秩相關分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同組織中axin蛋白表達情況的比較

正常胃黏膜組織中axin蛋白的陽性表達率為75.9%（60/79），高于胃癌組織的51.9%（41/79）和癌前病變組織的35.5%（11/31），差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=4.367、6.588，P＜0.05）；胃癌組織和癌前病變組織中axin蛋白的陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（圖1）

圖1 不同組織中axin 蛋白的表達情況（免疫組織化學染色，×400）

2.2 不同組織中METTL14蛋白表達情況的比較

正常胃黏膜組織中METTL14蛋白的陽性表達率為83.5%（66/79），高于胃癌組織的35.4%（28/79）和癌前病變組織的61.3%（19/31），差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=7.263，5.427，P＜0.05）；胃癌組織中METTL14蛋白的陽性表達率低于癌前病變組織，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.521，P＜0.05）。（圖2）

圖2 不同組織中METTL14蛋白的表達情況（免疫組織化學染色，×400）

2.3 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中axin和METTL14蛋白表達情況的比較

不同性別、年齡、腫瘤部位的胃癌患者胃癌組織中axin和METTL14蛋白的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移、中+高分化的胃癌患者胃癌組織中axin蛋白的陽性表達率均高于臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移、低分化的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=6.124、5.697、6.134，P＜0.05）；臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移、中+高分化的胃癌患者胃癌組織中METTL14蛋白的陽性表達率均高于臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移、低分化的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=4.598、4.190、5.893，P＜0.05）。（表2）

2.4 METTL14與axin 蛋白表達的相關性分析

79例胃癌組織中，METTL14與axin共陽性表達24例，共陰性表達14例，且METTL14和axin表達呈正相關（r=0.569，P＜0.01）。31例癌前病變組織中，METTL14與axin共陽性表達9例，共陰性表達10例，且METTL14和axin表達呈正相關（r=0.372，P＜0.01）。

表2 不同臨床特征胃癌患者胃癌組織中axin和METTL14蛋白的表達情況（n=79）

3 討論

胃癌是中國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，早期發(fā)現(xiàn)較為困難，一般在偶然檢查中發(fā)現(xiàn)，往往已處于晚期，給患者及家屬帶來巨大的精神壓力和經濟負擔[8]。胃癌的發(fā)病原因復雜，涉及抑癌基因和癌基因的表達及細胞生物學改變等[9-10]。近年來許多研究者致力于研究胃癌的發(fā)病原因、機制及其治療方法，但結果仍不理想，因此，盡快準確地診斷和治療胃癌具有重要意義[11-13]。axin基因是研究人員在研究小鼠融合基因時發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，具有數(shù)量眾多的蛋白結合點，能夠有效地調節(jié)腫瘤細胞的分化和增殖[14-16]。METTL14是在哺乳動物體內發(fā)現(xiàn)的甲基轉移酶，研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中METTL14的表達水平明顯低于對應的癌旁組織，同時還發(fā)現(xiàn)METTL14能夠通過影響細胞周期中RNA甲基化過程，從而影響肝癌的發(fā)展[17-18]。也有部分研究者提出axin和METTL14在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的協(xié)同作用，但其作用機制尚未明確，這也成為國內外醫(yī)護工作者研究的重點[19]。

研究表明，axin表達情況與食管鱗狀細胞癌患者的淋巴結轉移情況和浸潤深度密切相關[20]。另有研究結果顯示，胃癌細胞中axin基因突變率為9.7%，說明胃癌的發(fā)生可能與axin基因突變有關[5]。本研究結果顯示，正常胃黏膜組織中axin蛋白的陽性表達率為75.9%，高于胃癌組織和癌前病變組織的51.9%和35.5%，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；不同性別、年齡和腫瘤部位的胃癌患者胃癌組織中axin蛋白的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移、中+高分化的胃癌患者胃癌組織中axin蛋白的陽性表達率均高于Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移、低分化的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明axin表達水平與胃癌的發(fā)生發(fā)展關系密切，同時還與分化程度、臨床分期、淋巴結轉移情況有關。這也表明axin可能成為新的診斷和治療胃癌的重要指標，可為胃癌的藥物靶向治療提供參考依據(jù)。本研究還發(fā)現(xiàn)，胃癌組織和癌前病變組織中axin蛋白的表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明胃癌細胞中axin基因可能已經發(fā)生了突變，導致其蛋白表達水平下降。有研究者對胃癌患者胃癌組織及其癌旁組織中METTL14的表達情況進行分析，結果顯示，癌旁組織中METTL14的表達水平明顯高于胃癌組織[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，正常胃黏膜組織中METTL14蛋白的陽性表達率為83.5%，高于胃癌組織和癌前病變組織的35.4%和61.3%，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；且胃癌組織中METTL14蛋白的陽性表達率低于癌前病變組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明METTL14表達水平與胃癌的發(fā)生發(fā)展關系密切。同時本研究還發(fā)現(xiàn)，不同性別、年齡和腫瘤部位的胃癌患者胃癌組織中METTL14蛋白的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移、中+高分化的胃癌患者胃癌組織中METTL14蛋白的陽性表達率均高于臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移、低分化的患者，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。說明METTL14與胃癌的轉移、侵襲有關，可為胃癌的治療提供靶點。本研究結果顯示，79例胃癌組織中，METTL14與axin共陽性表達24例，共陰性表達14例，且METTL14和axin表達呈正相關（P＜0.01）；31例癌前病變組織中，METTL14與axin共陽性表達9例，共陰性表達10例，且METTL14和axin表達呈正相關（P＜0.01）。說明兩者可能存在協(xié)同作用，共同抑制胃癌細胞的分化、增殖和轉移。axin和METTL14共同作用或者在其他因子的共同作用下，協(xié)同調節(jié)機體內干細胞的分化，對腫瘤細胞的分化和增殖具有抑制作用，這與國內有關研究結果一致[22]。

綜上所述，胃癌組織和癌前病變組織中axin和METTL14蛋白陽性表達率均低于正常胃黏膜組織，且兩者的表達呈正相關，提示兩者對胃癌的發(fā)生均具有抑制作用，聯(lián)合檢測可作為胃癌診斷和治療的依據(jù)。然而本研究的樣本量較小，結果可能具有一定的局限性，尚需進一步研究驗證。