T淋巴細(xì)胞亞群在早期三陰性乳腺癌新輔助化療療效預(yù)測中的應(yīng)用

鄭建偉，曹李，康春博#

1航天中心醫(yī)院普通外科，北京100049

2解放軍總醫(yī)院普通外科，北京100853

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，約占全部女性惡性腫瘤的18%，發(fā)病率居女性惡性腫瘤第一位，病死率居女性惡性腫瘤第二位[1]。乳腺癌術(shù)前行新輔助化療可以減少腫瘤微轉(zhuǎn)移，降低腫瘤分期，提高手術(shù)切除率及保乳率?；熓侨幮匀橄侔雌激素受體（estrogen receptor，ER）陰性，孕激素受體（progestrogen receptor，PR）陰性，人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陰性]的主要治療手段，對患者進(jìn)行新輔助化療，可實(shí)現(xiàn)降期保乳的目標(biāo)。腫瘤患者的免疫功能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、療效密切相關(guān)，隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，細(xì)胞免疫治療成為乳腺癌治療研究的新熱點(diǎn)[2]。細(xì)胞免疫在腫瘤免疫中占有主導(dǎo)作用，尤其是T細(xì)胞的功能對于腫瘤的免疫監(jiān)測具有關(guān)鍵意義。淋巴細(xì)胞亞群水平是評價免疫功能的重要手段[3]，能夠總體反映機(jī)體當(dāng)前的免疫功能狀態(tài)。三陰性乳腺癌較其他類型乳腺癌有更強(qiáng)的免疫原性，因此本研究采用流式細(xì)胞術(shù)分析早期三陰性乳腺癌患者新輔助化療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化，進(jìn)一步探討T淋巴細(xì)胞亞群對新輔助化療的療效預(yù)測作用，為三陰性乳腺癌患者新輔助化療的決策提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年1月至2018年12月于解放軍總醫(yī)院普通外科進(jìn)行新輔助化療的女性三陰性乳腺癌患者的病歷資料，作為病例組。納入標(biāo)準(zhǔn)：行新輔助化療前均經(jīng)穿刺病理證實(shí)為浸潤性乳腺癌，且均有可測量的乳腺癌病灶，均無化療禁忌證。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者無病理診斷結(jié)果或非三陰性乳腺癌。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入三陰性乳腺癌患者44例，年齡38～65歲，中位年齡為52歲；美國癌癥聯(lián)合會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）腫瘤分期：Ⅱ期30例，Ⅲ期14例；浸潤性導(dǎo)管癌42例，浸潤性小葉癌1例，髓樣癌1例。選取同期行健康體檢的12例女性為對照組，年齡35～65歲，中位年齡為52歲。兩組研究對象的年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 化療方法

病例組患者采用表柔比星/多柔比星（EC/AC）序貫紫杉類（T）化療方案：表柔比星/多柔比星90/60 mg/m2，第1天，靜脈注射；環(huán)磷酰胺600 mg/m2，第1天，靜脈滴注；3周為1個周期，4個周期為一個療程；序貫多西他賽75～80 mg/m2或紫杉醇175 mg/m2，第1天，靜脈滴注；3周為1個周期，4個周期為一個療程。

1.3 檢測方法

病例組患者于新輔助化療前及化療8個周期后（未完成8個周期進(jìn)展患者在進(jìn)展時）評價療效時抽取外周靜脈血2 ml，肝素抗凝，各取 100 μl，分別加入鼠抗人CD3、CD4、CD8、CD16、CD28、CD25、CD56熒光標(biāo)記的單克隆抗體20 μl，閉光孵育30 min，加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）3 ml洗滌，1500 r/min離心5 min，棄上清液，加入PBS 1 ml混勻，上機(jī)檢測CD3+、CD3+/CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+、CD8+CD28+、CD3-CD16+CD56+自然殺傷（nature killer，NK）細(xì)胞比例，淋巴細(xì)胞亞群以中位值作為界值。單克隆抗體及流式細(xì)胞儀均購自美國BD公司，按試劑說明操作。對照組患者于健康體檢時留取外周靜脈血檢測，方法同病例組。

1.4 療效評價標(biāo)準(zhǔn)

采用實(shí)體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)1.1版（response evaluation criteria in solid tumors 1.1，RECIST 1.1）[4]評估患者的療效：完全緩解（CR），所有目標(biāo)病灶完全消失；部分緩解（PR），基線病灶長徑總和縮小≥30%；疾病進(jìn)展（PD），基線病灶長徑總和增加≥20%或出現(xiàn)新的病灶；疾病穩(wěn)定（SD），基線病灶長徑總和縮小但未達(dá)PR或增加未達(dá)PD。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；影響因素分析采用Logistic多因素回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 新輔助化療前病例組及對照組研究對象T淋巴細(xì)胞亞群比例的比較

新輔助化療前，病例組患者CD3+、CD3+CD8+及CD4+CD25+比例均高于對照組，CD8+CD28+比例低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組研究對象CD3+CD4+、CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞比例比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1）

表1 化療前病例組及對照組研究對象T淋巴細(xì)胞亞群比例的比較

2.2 新輔助化療前后病例組患者T淋巴細(xì)胞亞群比例的比較

新輔助化療后，病例組患者CD3+和CD3+CD8+比例均提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；新輔助化療前后病例組患者其他指標(biāo)比例比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表2 新輔助化療前后病例組患者T淋巴細(xì)胞亞群比例的比較（%，±s）

表2 新輔助化療前后病例組患者T淋巴細(xì)胞亞群比例的比較（%，±s）

注：*與化療后比較，P＜0.05

CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD4+CD25+CD8+CD28+CD3-CD16+CD56+NK 61.9±9.5*34.2±9.5 25.5±3.5*2.8±0.3 10.9±1.5 17.6±9.5 65.6±8.8 34.8±7.8 29.5±8.8 2.7±1.2 12.8±5.9 17.3±8.1化療前化療后

2.3 不同臨床特征的三陰性乳腺癌患者療效的比較

CD8+CD28+比例≥12.5%的三陰性乳腺癌患者療效明顯優(yōu)于CD8+CD28+比例＜12.5%的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.402，P=0.002）；不同年齡、病理類型、AJCC分期、淋巴結(jié)數(shù)目、組織學(xué)分級、Ki-67 及 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+CD25+、CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞比例的三陰性乳腺癌患者的療效比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表3）

表3 不同臨床特征的三陰性乳腺癌患者的療效

2.4 三陰性乳腺癌療效影響因素的Logistic多因素回歸分析

進(jìn)一步將CD8+CD28+T細(xì)胞（＜12.5%=1，≥12.5%=2）納入Logistic多因素回歸模型，發(fā)現(xiàn)CD8+CD28+T細(xì)胞比例仍為三陰性乳腺癌患者新輔助化療療效的影響因素（OR=1.361，95%CI=1.015～1.825，P=0.039）。

3 討論

化療是乳腺癌的重要治療手段。隨著化療療效的提高及乳腺癌患者生存時間的延長，化療對于腫瘤的其他作用越來越受到關(guān)注[5-6]。機(jī)體的免疫功能下降在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用[7]。越來越多的證據(jù)表明，免疫功能與抗體藥物療效相關(guān)，如曲妥珠單抗[8]，而且與日益發(fā)展的免疫治療療效密切相關(guān)[9]。因此，化療對于免疫功能的影響越來越受到重視。

細(xì)胞免疫在腫瘤免疫中占有主導(dǎo)地位，尤其是T細(xì)胞的功能對于腫瘤的免疫監(jiān)測具有關(guān)鍵意義。淋巴細(xì)胞亞群是分析免疫功能的重要手段[3]，CD3+細(xì)胞為總T細(xì)胞，根據(jù)功能又可將其分為CD4+和CD8+等亞群，CD4是輔助性T淋巴細(xì)胞的表面抗原，CD4+細(xì)胞不能直接識別腫瘤細(xì)胞，也不能直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而是把相關(guān)的腫瘤抗原呈遞給相應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞，從而特異性地激發(fā)活化的細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用。CD8+細(xì)胞為具有負(fù)調(diào)節(jié)效應(yīng)的抑制性T淋巴細(xì)胞，可引起細(xì)胞裂解及介導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡，從而特異性地直接殺傷腫瘤細(xì)胞[10]。CD4+CD25+可通過細(xì)胞接觸依賴機(jī)制或抑制性細(xì)胞因子依賴機(jī)制主動抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化，維持自身耐受，影響免疫系統(tǒng)對腫瘤的應(yīng)答。NK細(xì)胞屬于非特異性免疫細(xì)胞，無主要組織相容性復(fù)合體限制，不依賴抗體，主要是通過分泌各種細(xì)胞毒因子直接殺傷靶細(xì)胞，在體內(nèi)具有免疫監(jiān)視功能，對腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移具有抑制作用。

既往研究報(bào)道，在腫瘤患者外周血中可檢測到CD8+細(xì)胞比例升高，而 CD3+、CD4+、CD4+CD8+、NK細(xì)胞比例均下降[11-12]。腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生免疫抑制因子，抑制淋巴細(xì)胞分化增殖，導(dǎo)致CD4抗原減少，CD8+細(xì)胞反應(yīng)性增多，而增多的抑制性CD8+細(xì)胞又反過來抑制CD4+細(xì)胞，從而導(dǎo)致CD4+CD8+下降甚至倒置。隨著腫瘤的進(jìn)展，產(chǎn)生和分泌的抑制因子會越來越多，誘導(dǎo)CD8+細(xì)胞產(chǎn)生的同時也阻止 CD4+細(xì)胞的產(chǎn)生[13-15]。

本研究中病例組患者CD3+、CD3+CD8+及CD4+CD25+比例均高于對照組，CD8+CD28+比例低于對照組，均表明患者免疫功能紊亂。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者細(xì)胞免疫明顯受到抑制，隨著疾病的進(jìn)展，機(jī)體免疫功能逐漸降低[16]。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一個高度異質(zhì)性的群體，通過分泌各種不同的可溶性因子和直接接觸介導(dǎo)免疫抑制作用[17-18]。腫瘤患者外周血和腫瘤局部調(diào)節(jié)性T細(xì)胞均明顯升高，升高的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與腫瘤高負(fù)荷及不良預(yù)后相關(guān)[19-20]。既往關(guān)于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的報(bào)道尚不一致。早期的研究發(fā)現(xiàn)浸潤性乳腺癌患者中，分期晚者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例高[21]。而Sakaguchi[22]研究發(fā)現(xiàn)不同臨床分期的乳腺癌患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例無差異，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例高預(yù)示患者預(yù)后不良。

有效的新輔助化療可以降低腫瘤分期，縮小原發(fā)癌灶，提高手術(shù)率及保乳率，還可以抑制原發(fā)病灶和微小轉(zhuǎn)移灶，降低術(shù)后復(fù)發(fā)率，并提高生存率。經(jīng)過有效的治療后，免疫功能可恢復(fù)[23]。本研究中44例三陰性乳腺癌患者新輔助化療后CD3+和CD3+CD8+比例均提高，而CD4+CD25+T細(xì)胞、CD8+CD28+T細(xì)胞均無顯著變化，提示患者化療對于患者細(xì)胞免疫功能無明顯抑制作用。。

在進(jìn)一步探索患者臨床特征與新輔助化療療效關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，CD8+CD28+比例≥12.5%的三陰性乳腺癌患者療效明顯優(yōu)于CD8+CD28+比例＜12.5%的患者，進(jìn)一步證明了患者免疫功能與化療療效的關(guān)系?；熕幬镌跉[瘤細(xì)胞的同時，對機(jī)體的免疫系統(tǒng)也產(chǎn)生了顯著的影響[24]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為化療殺傷了免疫細(xì)胞，導(dǎo)致免疫細(xì)胞數(shù)量下降[25]，而進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)，不同的化療藥物可引起不同的免疫效應(yīng)，紫杉類藥物可顯著提高血清白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）與粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）的水平，刺激免疫效應(yīng)細(xì)胞增生，產(chǎn)生抗腫瘤的效果[26]。Melichar等[27]報(bào)道 CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+水平在多柔比星聯(lián)合紫杉醇的化療過程中明顯升高。

綜上所述，本研究進(jìn)一步證實(shí)了三陰性乳腺癌患者存在免疫功能失調(diào)，外周血淋巴細(xì)胞亞群水平能客觀地反映患者機(jī)體的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，監(jiān)測三陰性乳腺癌患者外周血淋巴細(xì)胞亞群水平對于新輔助化療療效預(yù)測具有一定的參考價值。