sMICA、CYFRA21-1、MMP9在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及與化療療效的關(guān)系

王麗華，郭君蘭，胡彥偉，焦智民

安陽市腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 安陽 455000

近年來，隨著人們生活習(xí)慣的改變和生活節(jié)奏的加快，食管癌的發(fā)病率呈不斷增長的趨勢。食管癌主要包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌兩種病理類型，其中以鱗狀細(xì)胞癌更為多見，預(yù)后差。早期食管鱗狀細(xì)胞癌一般經(jīng)手術(shù)治療可控制其病情進(jìn)展，而實際臨床就診的食管癌患者以中晚期居多，往往無法實施手術(shù)，且部分患者不愿接受手術(shù)治療，需采用化療干預(yù)[1]。腫瘤標(biāo)志物對于評估腫瘤患者的病情、治療效果及預(yù)測預(yù)后十分重要。近年來，陸續(xù)有報道指出，血清指標(biāo)中，可溶型主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類鏈相關(guān)蛋白A（soluble major histocompatibility complex classⅠchain-related protein A，sMICA）、細(xì)胞角質(zhì)蛋白19片段抗原21-1（cytokeratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1）及基質(zhì)金屬蛋白酶 9（matrix metalloprotein 9，MMP9）是重要的腫瘤標(biāo)志性分子，與腫瘤進(jìn)展或惡化密切相關(guān)[2-5]，但其在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況及臨床意義尚缺乏報道。為此，本研究以95例食管鱗狀細(xì)胞癌組織為對象，分析食管鱗狀細(xì)胞癌中sMICA、CYFRA21-1、MMP9的表達(dá)情況及與化療療效的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年1月至2017年1月安陽市腫瘤醫(yī)院收治的95例食管鱗狀細(xì)胞癌患者，取其食管鱗狀細(xì)胞癌組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：①通過病理檢查確診為食管鱗狀細(xì)胞癌；②未接受過胸部放療、化療及其他抗腫瘤治療；③因錯過手術(shù)時機、無法耐受手術(shù)或不愿接受手術(shù)治療，均接受化療干預(yù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①預(yù)計生存期＜3個月；②有其他消化系統(tǒng)腫瘤病史；③合并其他部位原發(fā)性腫瘤；④合并冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、糖尿病、肝硬化、慢性阻塞性肺疾病等慢性疾病。95例食管鱗狀細(xì)胞癌患者中，男57例，女38例；年齡26～75歲，中位年齡為53歲；病灶部位：食管上段51例，食管中段44例；美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）食管癌 TNM 分期[6]：Ⅰ期 19例，Ⅱ期42例，Ⅲ期34例；分化程度：中低分化45例，高分化50例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均了解本次研究的目的和意義并簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器

兔抗人sMICA多克隆抗體、兔抗人CYFRA21-1多克隆抗體、兔抗人MMP9多克隆抗體及二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-perosidase，SP）試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，PAS染色液由安陽市腫瘤醫(yī)院實驗室配置。恒溫干燥箱購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠，醫(yī)學(xué)顯微鏡及其配套圖像采集系統(tǒng)購自日本OLYMPUS公司。

1.3 sMICA、CYFRA21-1、MMP9檢測及判定標(biāo)準(zhǔn)

均通過活檢取得全部患者的食管鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本，經(jīng)過甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋，制作成4 μm厚的連續(xù)切片，采用免疫組化SP法檢測，均采取磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）代替一抗作為陰性對照；操作嚴(yán)格按照說明進(jìn)行，每批染色均以sMICA、CYFRA21-1、MMP9已知陽性切片作為陽性對照。結(jié)果由兩位高資歷病理科醫(yī)師采用雙盲法觀察每張切片，sMICA、CYFRA21-1、MMP9蛋白陽性表達(dá)細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜出現(xiàn)區(qū)別于背景色的棕黃色細(xì)顆粒。400倍顯微鏡下取典型食管鱗狀細(xì)胞癌區(qū)10個視野觀察，根據(jù)陽性細(xì)胞的染色強度和陽性細(xì)胞所占百分比進(jìn)行評分。陽性細(xì)胞染色強度：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞所占百分比：顯微鏡下觀察10個高倍視野（×400），每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，取10個視野的百分比平均數(shù)，＜5%為0分，≥5%且＜25%為1分，≥25%且＜50%為2分，≥50%且＜75%為3分，≥75%為4分。染色強度評分與陽性細(xì)胞所占百分比評分相乘，結(jié)果以0～4分為陰性表達(dá)，5～12分為陽性表達(dá)。

1.4 療效評價標(biāo)準(zhǔn)

所有患者均接受化療，并保持密切隨訪，隨訪期間行肝腎功能檢查及胸部計算機斷層掃描（CT）復(fù)查?；熃Y(jié)束后4周參考實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)1.1版[7]評價近期療效：完全緩解（CR），食管鱗狀細(xì)胞癌病灶消失且維持至少4周；部分緩解（PR），食管鱗狀細(xì)胞癌病灶長徑總和較前縮小≥30%，且維持至少4周；疾病進(jìn)展（PD），食管鱗狀細(xì)胞癌病灶長徑總和較前增加≥20%或出現(xiàn)新病灶；病情穩(wěn)定（SD），介于PR與PD之間；總有效率（overall response rate，ORR）=（CR+PR）例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；等級資料的比較采用秩和檢驗；療效的影響因素分析采用多元Cox回歸分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 sMICA、CYFRA21-1、MMP9的表達(dá)情況

95例食管鱗狀細(xì)胞癌組織中，59例食管鱗狀細(xì)胞癌組織中sMICA呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為62.11%，表現(xiàn)為淡黃色至深棕色顆粒，定位于細(xì)胞質(zhì)；62例食管鱗狀細(xì)胞癌組織中CYFRA21-1呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為65.26%，表現(xiàn)為淡黃色至深棕色顆粒，定位于細(xì)胞質(zhì)；75例MMP9呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為78.95%，表現(xiàn)為淡黃色至棕褐色顆粒，定位于細(xì)胞質(zhì)。（圖1）

2.2 不同臨床特征食管鱗狀細(xì)胞癌患者的食管鱗狀細(xì)胞癌組織中sMICA、CYFRA21-1、MMP9表達(dá)情況的比較

圖1 食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中sMICA、CYFRA21-1、MMP9陽性、陰性表達(dá)情況（免疫組化染色，×400）

不同TNM分期的食管鱗狀細(xì)胞癌患者的食管鱗狀細(xì)胞癌組織中sMICA、CYFRA21-1、MMP9陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=26.904、18.767、10.167，P＜0.05）；不同分化程度的食管鱗狀細(xì)胞癌患者的食管鱗狀細(xì)胞癌組織中sMICA、CYFRA21-1、MMP9陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=11.634、3.995、10.646，P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征食管鱗狀細(xì)胞癌患者的食管鱗狀細(xì)胞癌組織中sMICA、CYFRA21-1、MMP9的表達(dá)情況（n=95）

2.3 sMICA、CYFRA21-1、MMP9表達(dá)情況與化療療效的關(guān)系

95例食管鱗狀細(xì)胞癌患者化療后，CR 25例，PR 31例，SD 21例，PD 18例，ORR為58.95%（56/95）。sMICA、CYFRA21-1、MMP9陰性表達(dá)的患者療效均優(yōu)于陽性表達(dá)的患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=2.522、2.752、2.746，P＜0.05）。（表2）

表2 不同sMICA、CYFRA21-1、MMP9表達(dá)情況的食管鱗狀細(xì)胞癌患者的療效情況

2.4 食管鱗狀細(xì)胞癌患者化療療效影響因素的多元Cox 回歸分析

以食管鱗狀細(xì)胞癌患者化療療效為因變量，以TNM分期、分化程度及sMICA、CYFRA21-1、MMP9表達(dá)為自變量（賦值情況：Ⅰ期=0，Ⅱ期=1，Ⅲ期=2；高分化=0，中低分化=1；sMICA陰性=0，陽性=1；CYFRA21-1陰性=0，陽性=1；MMP9陰性=0，陽性=1），進(jìn)行多元Cox回歸分析，結(jié)果顯示，TNM分期、分化程度及sMICA、CYFRA21-1、MMP9表達(dá)均是食管鱗狀細(xì)胞癌患者化療療效的獨立影響因素（P＜0.01）。（表3）

表3 食管鱗狀細(xì)胞癌患者化療療效影響因素的多元Cox回歸分析

3 討論

腫瘤細(xì)胞凋亡后細(xì)胞表面的MICA脫落到外周血里可形成sMICA，研究報道，在肺癌、乳腺癌等患者中sMICA水平較健康者及相應(yīng)良性病變者高[8-9]。此外，從腫瘤免疫學(xué)角度分析，sMICA可降低腫瘤表面MICA的表達(dá)，誘導(dǎo)T細(xì)胞與自然殺傷細(xì)胞表面的活化受體發(fā)生內(nèi)化降解，從而對自然殺傷細(xì)胞的殺傷活性產(chǎn)生抑制作用，引起腫瘤逃逸[10]。CYFRA21-1是角蛋白CK19的片段（屬于酸性蛋白），通常分布在層狀或鱗狀上皮等正常組織表面，而當(dāng)細(xì)胞發(fā)生癌變時，CYFRA21-1在惡性上皮細(xì)胞中可激活蛋白酶，促進(jìn)細(xì)胞的降解，繼而可出現(xiàn)在上皮腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，并可大量釋放入血。CYFRA21-1對食管鱗狀細(xì)胞癌的診斷靈敏度較高，如樊衛(wèi)等[11]的研究證實CYFRA21-1與其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測能提高食管鱗狀細(xì)胞癌診斷的靈敏度（＞90%）和準(zhǔn)確度（＞85%）。作為MMP家族中分子量最大的酶，MMP9可作用于細(xì)胞外基質(zhì)而使細(xì)胞外蛋白水解，水解片段可沉積于腫瘤微環(huán)境中，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲。研究顯示，MMP9還具有分解層粘連蛋白、纖維連接蛋白、彈性蛋白等多種底物的作用，繼而可破壞機體防御腫瘤浸潤的天然防線[12]。MMP9在包括食管癌在內(nèi)的許多上皮來源的腫瘤或間質(zhì)腫瘤中過表達(dá)。張魯川等[13]研究指出，低分化及晚期食管鱗狀細(xì)胞癌易形成血管生成擬態(tài)，而MMP9對其有促進(jìn)作用。另有學(xué)者認(rèn)為，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中，MMP可通過某種作用機制促使sMICA介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的發(fā)生[14]。本研究選取通過病理確診的95例食管鱗狀細(xì)胞癌患者，通過手術(shù)取得組織標(biāo)本，經(jīng)甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋、切片，采用免疫組化SP法檢測sMICA、CYFRA21-1、MMP9表達(dá)情況。結(jié)果顯示，食管鱗狀細(xì)胞癌組織中sMICA陽性表達(dá)59例（62.11%），CYFRA21-1陽 性 表 達(dá) 62例（65.26%），MMP9陽性表達(dá)75例（78.95%）；且不同TNM分期及分化程度的食管鱗狀細(xì)胞癌患者的食管鱗狀細(xì)胞癌組織中sMICA、CYFRA21-1、MMP9陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；表明腫瘤標(biāo)志性分子sMICA、CYFRA21-1、MMP9在食管鱗狀細(xì)胞癌中陽性表達(dá)率高，可能參與了腫瘤的進(jìn)展。

目前，關(guān)于上述3種腫瘤標(biāo)志物與食管鱗狀細(xì)胞癌療效的關(guān)系尚無明確報道，僅梁敏等[15]的報道認(rèn)為全腔鏡食管癌根治術(shù)聯(lián)合紫杉醇類+鉑類（TP）化療方案有助于降低患者血清sMICA、CYFRA21-1、MMP9水平，認(rèn)為其可能與臨床療效及預(yù)后密切相關(guān)。本研究95例患者化療后ORR達(dá)58.95%，進(jìn)一步統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)sMICA、CYFRA21-1、MMP9陰性表達(dá)的患者療效優(yōu)于陽性表達(dá)的患者，且多元Cox回歸分析結(jié)果提示，TNM分期、分化程度、sMICA、CYFRA21-1、MMP9表達(dá)均是食管鱗狀細(xì)胞癌患者化療療效的獨立影響因素，提示腫瘤標(biāo)志性分子sMICA、CYFRA21-1、MMP9在食管鱗狀細(xì)胞癌中的高陽性表達(dá)率可能影響化療療效，可能與sMICA、CYFRA21-1、MMP9直接或間接影響食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖與凋亡，進(jìn)而參與疾病進(jìn)展及影響化療敏感性有關(guān)，但具體影響機制仍需進(jìn)一步探討。此外，由于目前本研究所選病例大部分仍在隨訪中，sMICA、CYFRA21-1、MMP9對患者生存情況的影響還需后期補充論證。