泛素樣含PHD和環(huán)指域1在鼻咽癌放化療患者中的表達(dá)水平及與患者預(yù)后的關(guān)系

谷泉，彭愛麗，王玉玨，趙暘，陳志強(qiáng)

1沈陽市第四人民醫(yī)院耳鼻喉科，沈陽 110000

解放軍第四六三醫(yī)院2耳鼻喉科，3病理科，沈陽 110041

鼻咽癌作為惡性腫瘤性疾病，在中國，尤其是南方地區(qū)高發(fā)，且發(fā)病率持續(xù)上升。研究發(fā)現(xiàn)，中國鼻咽癌患者的發(fā)病和病死人數(shù)分別占全球鼻咽癌發(fā)病和病死總?cè)藬?shù)的38.29%和40.14%，發(fā)病率和病死率高于世界平均水平（1.2/10萬和0.7/10萬），且男性多于女性[1]。中國的多數(shù)鼻咽癌患者確診時(shí)已發(fā)展為晚期，5年生存率僅為62.69%[2]。鼻咽癌患者發(fā)病初期無明顯臨床癥狀，主要表現(xiàn)為打噴嚏、流膿涕、鼻塞、涕中帶血、耳悶和聽力下降等癥狀，嚴(yán)重者還會引發(fā)眶周陣發(fā)性疼痛[3]。局部復(fù)發(fā)、局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移常導(dǎo)致鼻咽癌患者的病情加重，也是導(dǎo)致鼻咽癌患者放射治療后失敗的主要原因[4-5]。目前，在中國，放化療是鼻咽癌的主要治療方式，但是，在治療過程中，患者會出現(xiàn)一系列嚴(yán)重的不良反應(yīng)，且不能改善患者的生存情況[6]。在放化療期間，由于缺乏靈敏度和特異度均較高的鼻咽癌診斷指標(biāo)，常常出現(xiàn)放化療過度的情況，影響鼻咽癌患者的預(yù)后。因此，亟需在鼻咽癌患者的放化療期間尋求具有較高靈敏度和特異度的指標(biāo)來指導(dǎo)鼻咽癌患者臨床放化療的程度和時(shí)間，以達(dá)到最佳的治療效果。泛素樣含PHD和環(huán)指域1（ubiquitin like with PHD and ring finger domains 1，UHRF1）是一種與細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程密切相關(guān)的核蛋白基因，在人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。UHRF1定位于人類染色體19p13.3上[7]。UHRF1在整個(gè)腫瘤細(xì)胞周期中均有表達(dá)，且不受細(xì)胞周期的調(diào)控，隨著細(xì)胞增殖能力的提高，UHRF1的表達(dá)量也隨之提高，在腫瘤細(xì)胞中升高異常明顯。鑒于其在人類多種腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，目前，UHRF1被認(rèn)為在宮頸癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌等多種腫瘤中具有腫瘤標(biāo)志物的價(jià)值[8-10]。但是，關(guān)于UHRF1在鼻咽癌中的作用的報(bào)道較少。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）對122例鼻咽癌患者鼻咽癌組織中UHRF1的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，通過分析鼻咽癌患者鼻咽癌組織中UHRF1的表達(dá)與患者臨床特征和預(yù)后的關(guān)系，探討其作為鼻咽癌腫瘤標(biāo)志物的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2003年1月至2010年12月沈陽市第四人民醫(yī)院收治的122例接受根治性治療鼻咽癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①主要癥狀為流鼻涕、鼻塞、聽力下降和頭痛等；②經(jīng)組織細(xì)胞學(xué)、病理學(xué)檢查確診為鼻咽癌；③經(jīng)磁共振成像（MRI）和計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）等影像學(xué)檢查顯示存在可測量病灶；④行放化療或手術(shù)等根治性治療；⑤卡氏功能狀態(tài)（Karnofsky performance status，KPS）評分≥70分；⑥心電圖、血常規(guī)檢查正常；⑦預(yù)計(jì)生存期超過6個(gè)月。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并精神、意識障礙；②合并肝、腎功能不全；③合并心腦血管疾病。122例鼻咽癌患者中，男88例，女34例；年齡為49～75歲，平均年齡為（54.0±2.2）歲；TNM分期[11]：Ⅰ期10例，Ⅱ期17例，Ⅲ期32例，Ⅳ期63例。收集122例鼻咽癌患者的鼻咽癌組織標(biāo)本和14例疑似鼻咽癌患者經(jīng)檢驗(yàn)為陰性樣本的正常組織。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批通過，所有研究對象均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 組織樣本采集方法

所有疑似鼻咽癌患者均進(jìn)行纖鼻咽鏡檢查，發(fā)現(xiàn)異常者通過纖維鼻咽鏡獲取122例鼻咽癌患者的鼻咽癌組織（1 cm3大小），經(jīng)生理鹽水清洗后，樣品保存于-80℃冰箱備用?；顧z組織通過病理學(xué)檢查確診后，患者采取外照射、腔內(nèi)近距離放療、X線立體定向放療和組織間插植和化療等根治性治療。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測鼻咽癌組織中UHRF1表達(dá)水平

觀察不同臨床分期鼻咽癌患者鼻咽癌組織及正常組織中UHRF1的表達(dá)水平。取出凍存組織，采用RNA提取試劑盒提取RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA，采用熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測，上述試劑盒均購自中國北京全式金生物技術(shù)有限公司。根據(jù)UHRF1序列，參照劉新城[12]的方法設(shè)計(jì)PCR引物（表1）。根據(jù)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線計(jì)算UHRF1mRNA的表達(dá)水平。UHRF1的表達(dá)情況由2位臨床醫(yī)師在不知患者臨床資料的情況下進(jìn)行評價(jià)。將UHRF1的表達(dá)水平由低到高進(jìn)行劃分，其中，UHRF1在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平與UHRF1在正常組織中的表達(dá)水平相同，記為“-”；UHRF1在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平是UHRF1在正常組織中表達(dá)水平的2～4倍，記為“+”；UHRF1在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平是UHRF1在正常組織中表達(dá)水平的5～6倍，記為“++”；UHRF1在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平是UHRF1在正常組織中表達(dá)水平的6倍以上，記為“+++”?！?”表示UHRF1陰性表達(dá)，“+、++、+++”表示UHRF1陽性表達(dá)。

表1 UHRF1和GAPDH引物序列

1.4 隨訪

所有患者于放化療期間每周體檢1～2次，所有患者治療結(jié)束1個(gè)月后以門診、電話等方式進(jìn)行隨訪，5年后隨訪終止，如通過電話無法聯(lián)系到患者或其家屬時(shí)定為失訪。隨訪內(nèi)容：患者的治療效果和術(shù)后生存情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中UHRF1的表達(dá)水平

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測結(jié)果顯示，正常組織、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期鼻咽癌患者鼻咽癌組織中UHRF1的表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=580.592，P＜0.01）。隨著TNM分期的增高，鼻咽癌患者鼻咽癌組織中UHRF1的表達(dá)水平逐漸升高。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期鼻咽癌患者鼻咽癌組織中UHRF1的表達(dá)水平均高于正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期鼻咽癌患者鼻咽癌組織中UHRF1的表達(dá)水平均高于Ⅰ期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Ⅲ和Ⅳ期鼻咽癌患者鼻咽癌組織中UHRF1的表達(dá)水平均高于與Ⅱ期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Ⅳ期鼻咽癌患者鼻咽癌組織中UHRF1的表達(dá)水平高于Ⅲ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 122例鼻咽癌患者鼻咽癌組織和14例正常組織中UHRF1 mRNA的表達(dá)水平（±s）

表2 122例鼻咽癌患者鼻咽癌組織和14例正常組織中UHRF1 mRNA的表達(dá)水平（±s）

注：a與正常組織比較，P＜0.05；b與Ⅳ期鼻咽癌組織比較，P＜0.05；c與Ⅲ期鼻咽癌組織比較，P＜0.05；d與Ⅱ期鼻咽癌組織比較，P＜0.05

組織類型正常組織（n=14）Ⅰ期鼻咽癌組織（n=10）Ⅱ期鼻咽癌組織（n=17）Ⅲ期鼻咽癌組織（n=32）Ⅳ期鼻咽癌組織（n=63）UHRF1 mRNA表達(dá)0.94±0.15 1.45±0.42a b c d 2.45±0.24a b c 4.45±0.31a b 6.45±0.66a

2.2 不同臨床特征鼻咽癌患者鼻咽癌組織中UHRF1的表達(dá)情況

不同分化程度、TNM分期鼻咽癌患者鼻咽癌組織中UHRF1的陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），不同年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況鼻咽癌患者鼻咽癌組織中UHRF1的陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表3）

表3 122例不同臨床特征鼻咽癌患者鼻咽癌組織中UHRF1的陽性表達(dá)情況

2.3 不同UHRF1表達(dá)情況的鼻咽癌患者的術(shù)后生存情況

不同UHRF1表達(dá)情況的鼻咽癌患者的1、2和3年生存率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同UHRF1表達(dá)情況的鼻咽癌患者的4、5年生存率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。隨著UHRF1表達(dá)水平的升高，鼻咽癌患者的5年生存率逐漸降低；隨著隨訪年限的增長，鼻咽癌患者的生存率逐漸降低（χ2=13.114、38.406、59.396、67.248，P＜0.01）。（表4）

表4 不同UHRF1表達(dá)情況鼻咽癌患者的術(shù)后生存情況[n（%）]

3 討論

鼻咽癌是中國常見的頭頸部惡性腫瘤，放化療是其主要治療方式，但是由于缺乏敏感的臨床指標(biāo)，過度放化療現(xiàn)象時(shí)常發(fā)生。UHRF1作為鼻咽癌的腫瘤標(biāo)志物具有重要研究價(jià)值。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測鼻咽癌患者鼻咽癌組織中UHRF1的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UHRF1在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平隨著患者TNM分期的增加而逐漸升高，表明UHRF1的表達(dá)水平與鼻咽癌患者的TNM分期可能有關(guān)，但與患者的年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況可能無關(guān)。UHRF1的表達(dá)水平與治療后每年的鼻咽癌患者的存活人數(shù)呈負(fù)相關(guān)，說明UHRF1的表達(dá)強(qiáng)度可以作為監(jiān)測鼻咽癌患者預(yù)后情況的重要指標(biāo)。

UHRF1的腫瘤標(biāo)志物作用可能是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的。Hopfner等[13]研究發(fā)現(xiàn)，UHRF1通過調(diào)節(jié)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（TopoⅡ）的表達(dá)阻斷細(xì)胞間接觸抑制的信號，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。Jeanblanc等[14]研究發(fā)現(xiàn)，UHRF1的高表達(dá)促進(jìn)了TopoⅡ的表達(dá)，同時(shí)，UHRF1的功能結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)組蛋白翻譯后修飾及DNA甲基化過程，抑制抑癌基因的表達(dá)，啟動腫瘤細(xì)胞的生長[10]。UHRF1通過自身泛素化和泛素化核蛋白（PEST），降解細(xì)胞周期相關(guān)蛋白或某些轉(zhuǎn)錄因子，使腫瘤細(xì)胞不受細(xì)胞周期的調(diào)控，從而過度增殖。Achour等[15]發(fā)現(xiàn)UHRF1的下調(diào)能夠降低血管表皮生長因子的基因表達(dá)，并增強(qiáng)p16（INK4A）和RB1的基因表達(dá)。說明UHRF1能夠通過對腫瘤內(nèi)血管表皮生長因子的表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)從而對腫瘤的形成起營養(yǎng)支持作用。因此，UHRF1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中均具有重要作用。

綜上所述，鼻咽癌患者鼻咽癌組織中UHRF1的表達(dá)水平與鼻咽癌細(xì)胞的分化程度和鼻咽癌的TNM分期可能有關(guān)，且UHRF1的表達(dá)水平越高，患者的預(yù)后越差。UHRF1作為鼻咽癌的腫瘤標(biāo)志物，將為鼻咽癌的臨床診斷和治療提供可靠、準(zhǔn)確的理論依據(jù)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。