沉默HMGA2表達對人結腸癌HCT116細胞增殖及侵襲能力的影響△

徐廣甍，張海娜，姜丹，張麗梅，丁相福

吉林大學第二醫(yī)院1結直腸外科，2康復醫(yī)學科，3甲狀腺外科，長春 130022

結直腸癌是全世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。盡管近年來治療技術取得了巨大的進展，仍無法降低其發(fā)病率及病死率，發(fā)病人數(shù)及死亡人數(shù)呈增長趨勢[1]。惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，各種抑癌基因的突變及致癌基因的激活，是其重要的啟動及促進因素，并貫穿腫瘤進展的全程。致癌基因在正常組織中呈低表達或不表達，在腫瘤組織中則呈過表達，在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的促進作用。如能尋找出對腫瘤起重要調(diào)控作用的致癌基因，并對其表達進行有效調(diào)控，將有效抑制腫瘤的進展。所以，尋找并驗證在腫瘤進展過程中起重要調(diào)控作用的分子標志物，為惡性腫瘤發(fā)現(xiàn)新的診斷標志物及治療靶點，是目前腫瘤分子生物學研究的熱點。

高遷移率族蛋白A2（high mobility group AT-hook 2，HMGA2）蛋白屬于結構轉(zhuǎn)錄因子，其本身不具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的能力，但是可以通過其自身特有的AT鉤結構與被調(diào)節(jié)基因DNA上的AT富集區(qū)域相結合，或直接參與某些轉(zhuǎn)錄因子的作用，通過改變這些轉(zhuǎn)錄因子的DNA構象，增強或抑制其轉(zhuǎn)錄活性。大量的研究顯示HMGA2對胚胎發(fā)育、細胞增殖、糖尿病、肥胖癥、身高調(diào)節(jié)等生理過程具有重要作用，也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切[2-8]。最近的研究證據(jù)顯示HMGA2蛋白在一系列上皮來源惡性腫瘤中均存在表達上調(diào)，隨其表達程度的升高，明顯影響惡性腫瘤患者的臨床特征及預后。進一步的腫瘤分子生物學研究顯示，HMGA2在腫瘤的進展過程，如細胞增殖及周期調(diào)整、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、維持腫瘤干細胞功能等一系列事件中，均顯示出調(diào)控作用，在多種腫瘤進程中扮演了重要角色，可能成為新的特異性診斷標志物及抗腫瘤藥物治療靶點[9-19]。研究顯示，結腸癌組織中存在HMGA2的過表達，并且與患者臨床特征及預后相關，因此認為HMGA2是一個潛在的重要的結腸癌腫瘤標志物[20-21]。但是，關于其具體機制仍需進一步研究確認。

為鑒定HMGA2基因?qū)Y腸癌細胞生物學特性的影響，本研究成功構建針對HMGA2基因的干擾表達載體，并將其轉(zhuǎn)染HCT116細胞后構建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。通過沉默結腸癌HCT116細胞中HMGA2的表達，在細胞水平檢測其對HCT116細胞增殖及侵襲能力的影響，為進一步明確HMGA2功能并為其機制研究提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與材料

人結腸癌細胞系HCT116購自中國醫(yī)學科學院上海細胞庫。HMGA2抗體購自美國Abcam公司，Matrigel膠購自美國Sigma公司，Transwell小室購自美國Corning公司，標準蛋白、電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）反應檢測試劑盒、Cell Counting Kit-8試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

HCT116細胞貼壁生長于含10%FBS、青霉素（100 μg/ml）、鏈霉素（100 μg/ml）的 DMEM 培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中進行傳代培養(yǎng)。

1.3 HMGA2短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）表達載體的構建

根據(jù)前期試驗篩選驗證出有效的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）干擾序列：正義鏈序列，5'-GAAATGGCCACAACAAGTTGT-3'；反義鏈序列，5'-ACAACTTGTTGTGGCCATTTC-3'。設計出1對編碼HMGA2shRNA序列的互補單鏈DNA寡核苷酸序列，合成并構建pGP-U6/GFP/Neo/HMGA2RNAi重組質(zhì)粒（上海吉瑪生物技術有限公司）。陽性重組質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定與構建序列相符，陰性對照質(zhì)粒由上海吉瑪生物科技有限公司提供，經(jīng)blast驗證與HMGA2基因序列無同源性。

1.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選

取處于對數(shù)生長期的HCT116細胞，消化、收集后接種于6孔板中，每孔各接種1×105個細胞，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，應用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑進行重組質(zhì)粒及陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，應用熒光顯微鏡觀察確認轉(zhuǎn)染效率后，添加含G418（400 μg/ml）的DMEM培養(yǎng)基進行篩選陽性克隆并擴增傳代，構建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。按實驗需要，將未轉(zhuǎn)染細胞、轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒細胞及轉(zhuǎn)染HMGA2shRNA質(zhì)粒細胞分別命名為CON組、NC組、KD組。

1.5 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應及蛋白質(zhì)印跡法檢測HMGA2mRNA 及蛋白表達水平

分別提取各組細胞總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）。先合成cDNA，再進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR），擴增產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。HMGA2引物序列：上游引物 ，5'-AAGTTGTTCAGAAGAAGCCTGCTCA-3'；下游引物，5'-TGGAAAGACCATGGCAATACAGAAT-3'；長度174 bp。GAPDH引物序列：上游引物，5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'；下游引物，5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'；長度 138 bp。應用凝膠成像分析系統(tǒng)分析結果，HMGA2mRNA相對表達水平以HMGA2條帶灰度值與同組GAPDH條帶灰度值的比值表示。

分別提取各組細胞的總蛋白，采用標準曲線法對蛋白濃度進行測定，并行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜后以5%脫脂牛奶室溫下封閉l h，加入一抗（HMGA2抗體1∶200稀釋，GAPDH抗體1∶2000稀釋）在4℃條件下過夜。棄一抗，硝酸纖維素膜以l×Tris緩沖生理鹽水（tris buffered saline，TBS）（高鹽）清洗 3次，每次10 min；再加入二抗（1∶1000稀釋），室溫條件下作用2 h。棄二抗后，NC膜以l×TBS清洗3次，每次10 min；按照ECL說明書進行曝光處理。應用Quantity One軟件進行灰度分析處理，HMGA2蛋白相對表達量以HMGA2灰度值與同組GAPDH灰度值的比值表示。

1.6 CCK-8法檢測細胞增殖能力

分別消化、收集各組細胞，離心5min（1000r/min），制備單細胞懸液，細胞密度調(diào)至1×104/ml。各組分別取100 μl加至96孔板中，設定實驗分組并標記，每組設6個平行孔。培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2、飽和濕度），24、48、72、96、120 h后分別取出，向各待測孔中加入10 μl CCK-8溶液，置于37℃下孵育1 h，以酶標儀進行490 nm處吸光度值測定。

1.7 平板克隆形成實驗檢測細胞增殖能力

分別消化、收集各組細胞并制備單細胞懸液，計數(shù)并判定細胞活力，各取1000個細胞加入到含有37℃預溫培養(yǎng)液的6孔板中，使細胞分散均勻，設3個平行復孔。培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2、飽和濕度）中培養(yǎng)，14天后取出。各組細胞磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗2次，多聚甲醛溶液固定15 min；棄除固定液后再應用PBS溶液沖洗2次，適量Giemsa染液染色10 min，自來水緩慢沖洗后，室溫下干燥。在顯微鏡下分別對各組細胞中包含細胞數(shù)大于50的克隆計數(shù)。

1.8 侵襲實驗檢測細胞體外侵襲能力

以稀釋Matrigel膠均勻包被上室膜上表面，制備Transwell小室模型備用。消化、收集各組細胞并制備單細胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細胞密度至2.5×106/ml。下室加入 500 μl含 20%FBS 培養(yǎng)液，上室加入200 μl單細胞懸液，將上室嵌入到下室，各組均設3個復孔。處理后的小室裝置置于培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2、飽和濕度）中培養(yǎng)24 h后，取出固定染色。在倒置顯微鏡低倍鏡視野下，對各濾膜隨機選取3個視野，對穿膜細胞計數(shù)，計算每個濾膜的平均細胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HMGA2mRNA 及蛋白相對表達量的比較

KD組細胞HMGA2mRNA及蛋白相對表達量均低于CON組及NC組細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結果顯示通過siRNA可穩(wěn)定沉默HMGA2表達，可進行后續(xù)細胞學相關研究。（表1）

表1 3組細胞HMGA2 mRNA及蛋白相對表達量的比較（±s）

表1 3組細胞HMGA2 mRNA及蛋白相對表達量的比較（±s）

注：*與KD組比較，P＜0.05

組別CON組NC組KD組F值P值HMGA2 mRNA 0.95±0.11*1.01±0.13*0.35±0.11 29.17＜0.01 HMGA2蛋白0.97±0.11*1.03±0.15*0.21±0.13 36.51＜0.01

2.2 CCK-8法檢測細胞增殖能力結果

通過CCK-8法檢測各組細胞的增殖能力，結果顯示，與CON組及NC組相比，KD組細胞增殖能力受到抑制，不同時間點KD組細胞吸光度值均低于CON組及NC組細胞，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同時間點各組細胞吸光度值的比較（±s）

表2 不同時間點各組細胞吸光度值的比較（±s）

注：*與KD組比較，P＜0.05

組別CON組NC組KD組F值P值24 h 0.23±0.02*0.18±0.01*0.17±0.01 15.19＜0.01 48 h 0.26±0.02*0.23±0.02*0.18±0.02 14.35＜0.01 72 h 0.32±0.03*0.22±0.02*0.21±0.01 18.57＜0.01 96 h 0.43±0.03*0.38±0.02*0.23±0.02 62.86＜0.01 120 h 0.53±0.04*0.49±0.03*0.26±0.02 62.85＜0.01

2.3 平板克隆形成實驗檢測結果

對各組細胞的有效克?。ò毎麛?shù)目大于50）分別計數(shù)，CON組及NC組細胞克隆數(shù)分別為（243.2±27.6）、（208.9±37.1）個，均多于 KD 組的（139.0±15.6）個，差異均有統(tǒng)計學意義（t=5.69、3.01，P＜0.05）；CON組與NC組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=1.29，P＞0.05）。（圖1）

圖1 CON組、NC組、KD 組細胞平板克隆形成實驗結果

2.4 侵襲實驗檢測細胞侵襲能力結果

通過顯微鏡對各組細胞穿膜情況進行檢測，CON組及NC組穿膜細胞數(shù)分別為（143.18±19.87）、（126.64±26.10）個，均多于 KD 組細胞的（69.53±7.24）個，差異均有統(tǒng)計學意義（t=6.03、3.65，P＜0.05）；CON組與NC組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.87，P＞0.05）。（圖2）

圖2 CON組、NC組、KD 組細胞侵襲實驗檢測結果（Gimesa染色，×100）

3 討論

HMGA2屬于結構轉(zhuǎn)錄因子家族成員，自身并不具備轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)功能，但可通過其自身的特有結構改變所作用基因的轉(zhuǎn)錄活性，而作用基因如為參與腫瘤信號通路關鍵基因，HMGA2的作用可對腫瘤的發(fā)生及發(fā)展起到巨大作用[2-8]。以往研究顯示，HMGA2作為致癌基因，對惡性腫瘤細胞的增殖、侵襲等生物學行為均具有重要調(diào)控作用，對惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有重要影響[12,16-17,19-22]。但在結直腸癌的以往研究中，HMGA2對腫瘤生物學行為的影響，包括對腫瘤增殖及侵襲能力的具體調(diào)控，仍缺乏全面系統(tǒng)的研究。本研究成功構建了HMGA2shRNA重組質(zhì)粒表達載體，轉(zhuǎn)染人結腸癌HCT116細胞，構建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，成功沉默了HMGA2的表達，通過一系列體外細胞實驗，系統(tǒng)地對HMGA2在結腸癌細胞的腫瘤生物學行為進行研究，進一步明確HMGA2在結腸癌細胞增殖及侵襲過程中所起的作用。

為研究HMGA2對結腸癌細胞增殖能力的影響，本研究分別采用兩種實驗方法對HMGA2干擾前后細胞增殖的變化進行檢測。CCK-8法檢測結果顯示，沉默HMGA2表達后結腸癌細胞的增殖能力明顯受到抑制。平板克隆形成實驗主要用于對細胞增殖能力的檢測，接種后的腫瘤細胞并不能均形成有效克隆，但形成有效克隆的細胞均具有較強的增殖能力，間接反映出腫瘤的增殖能力強弱。本實驗結果顯示沉默HMGA2表達后，KD組細胞不論在有效克隆的尺寸上，還是在有效克隆數(shù)量上，均小于CON組及NC組，顯示其增殖能力減弱。兩種實驗結果均提示沉默HMGA2表達明顯抑制了HCT116細胞的增殖能力。

侵襲能力是評價惡性腫瘤生物學行為強弱的重要指標。侵襲能力的強弱決定了腫瘤突破原發(fā)部位向外周組織浸潤并播散及轉(zhuǎn)移的能力，涉及復雜的生物學機制。目前主要通過構建Transwell小室模型評價腫瘤侵襲能力的強弱，其原理為惡性腫瘤細胞突破原發(fā)部位向外周侵襲過程中，需要先突破細胞的外基質(zhì)膜，而Transwell小室模型通過包被基質(zhì)膠，體外模擬了該過程。通過該實驗可以看出沉默HMGA2基因表達后，穿透基質(zhì)膠的穿膜細胞數(shù)減少，而CON組與NC組相比，透膜細胞數(shù)并未顯示出差異。通過對結果進行比較，提示沉默HMGA2表達可顯著抑制HCT116細胞的侵襲能力。

本研究通過體外實驗，對HMGA2在結腸癌細胞中的惡性生物學行為，包括增殖及侵襲能力進行了系統(tǒng)的研究。實驗結果提示HMGA2表達在結腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中，對細胞增殖、侵襲能力起到明顯的促進作用。這些實驗結果為深入研究HMGA2對結腸癌的調(diào)控機制提供了理論基礎，同時也提示HMGA2可能作為結腸癌治療干預的靶點，值得進一步深入研究。