棕櫚酸在體外通過促進凋亡作用抑制宮頸癌Hela細胞增殖的研究

周瑤瑤 陳鳳云 屠文駱

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤之一，居女性惡性腫瘤死亡的第2位，近年來其發(fā)病率呈逐年升高趨勢，早期宮頸癌首選手術(shù)治療，療效較好，但中晚期宮頸癌以放化療為主，部分患者預(yù)后不良[1]，如何提高中晚期宮頸癌患者以及復(fù)發(fā)宮頸癌患者的療效是目前婦科腫瘤領(lǐng)域的熱點問題。近年來對宮頸癌的研究不斷深入，但宮頸癌的具體發(fā)病機制仍不明確。因此，目前迫切需要進一步深入探討宮頸癌的具體發(fā)病機制，為宮頸癌尤其是中晚期及復(fù)發(fā)性宮頸癌的治療與預(yù)后提供新思路。棕櫚酸(Palmitateacid，PA)是16碳長鏈飽和脂肪酸，分子式為C16H32O2。它是棕櫚油中飽和脂肪酸的主要成分[2]，占其總脂肪酸含量的44%～52%[3]。它的生物學(xué)和藥理學(xué)活性廣泛，研究顯示其與代謝綜合征、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、炎癥等具有相關(guān)性[4-5]。最近的研究報道其有抗腫瘤作用[6]，主要應(yīng)用于乳腺癌和結(jié)腸癌[7]，但其抗宮頸癌的作用鮮有報道。此外，真核生物體內(nèi)細胞內(nèi)衰老、變性需依賴細胞內(nèi)凋亡途徑，從而調(diào)節(jié)細胞質(zhì)量和數(shù)量，而PA的具體抗腫瘤作用是否與其誘導(dǎo)凋亡相關(guān)尚未闡明。本研究在體外采用不同濃度PA處理人宮頸癌HeLa細胞，檢測PA對HeLa細胞的增殖抑制和促進凋亡作用，探討PA對宮頸癌HeLa細胞部分作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人類宮頸癌細胞HeLa系購自上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司；PA購自成都瑞芬思生物科技有限公司；胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基、二甲基亞砜(DMSO)購于美國Sigma公司；CCK-8購于日本同仁公司；膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶凋亡檢測試劑盒購于北京索萊寶公司；Transwell小室購于美國康寧公司；熒光倒置生物顯微鏡購于德國萊卡公司；Bio-Rad550酶標(biāo)儀購于美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、處理及分組 HeLa細胞使用含10% FBS的高糖DMEM完全培養(yǎng)基(完培)培養(yǎng)，待細胞長至80%～90%時，用PBS清洗2次，加入0.025%胰酶(含0.02% EDTA)消化。等細胞全部脫壁漂浮后，加入3倍體積的完全培養(yǎng)基中和胰酶，1 000 rpm離心5 min，棄去上清，用完全培養(yǎng)基重懸HeLa細胞，調(diào)整細胞濃度為1×105/mL的細胞懸液待用。PA溶于DMSO中，配成100 mg/mL母液保存于4℃冰箱。所有濃度的PA均由母液稀釋于高糖DMEM培養(yǎng)基中。HeLa細胞分為對照組(不加藥)、PA處理組(分別加入PA 25、50、100 μg/mL處理48 h)。

1.2.2 CCK-8實驗檢測PA毒性 取細胞懸液按100 μL/孔接種于96孔板中培養(yǎng)。將培養(yǎng)板在37℃，5% CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h后，將HeLa細胞分為對照組、PA處理組。隨后向每孔加10 μL CCK-8溶液，移入培養(yǎng)箱中繼續(xù)避光孵育1 h，取出培養(yǎng)板，用全自動酶標(biāo)儀在波長450 nm處測定每孔的吸光光度(OD)值，并繪制細胞增殖曲線。每個樣品每次含有3個復(fù)孔，結(jié)果來自3次獨立重復(fù)的實驗。

1.2.3 Transwell遷移侵襲試驗 將涂有50 μL基質(zhì)膠(基質(zhì)膠/無血清培養(yǎng)基：1/5)的Transwell小室，其孔徑為8 μm，放在一個24孔板上。將HeLa細胞(1×105個細胞/mL)用100 μL含有不同濃度PA(25、50、100 μg/mL)的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸，置于小室的上部。將600 μL完培加入小室的下部。將細胞在37℃下培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基，用濕棉簽刮擦每個Transwell室膜的上部以除去未發(fā)生遷移及侵襲的細胞。遷移及侵襲的細胞用4%多聚甲醛固定，并用0.2%結(jié)晶紫染色。從6個隨機選擇的顯微鏡視野計數(shù)平均遷移細胞數(shù)。

1.2.4 qRT-PCR檢測凋亡相關(guān)mRNA的表達 取細胞懸液按1 000 μL/孔接種于12孔板中培養(yǎng)。將培養(yǎng)板在37℃，5% CO2條件下的恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h后，將HeLa細胞分為對照組、PA處理組。隨后用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒分別提取各組細胞的總RNA。以紫外分光光度計A280、A260定量測定，使提取總RNA測量結(jié)果純度A280/A260為1.8～2.0，濃度≤500 ng/μL為合格。質(zhì)量合格的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，嚴格按照試劑盒說明書進行，反應(yīng)體系為25 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 5 min，94℃ 30 s，65℃ 30 s，重復(fù)40個循環(huán)，熔解曲線分析：溫度60～95℃。采用2-ΔΔCT法對數(shù)據(jù)進行相對定量分析，每個樣品每次含有2個復(fù)孔，結(jié)果來自3次獨立重復(fù)的實驗。具體引物序列見表1。

表1 qRT-PCR所用的引物序列

1.2.5 流式細胞實驗檢測細胞凋亡 取細胞懸液按2000 μL/孔接種于6孔板中培養(yǎng)。將HeLa細胞分為對照組、PA處理組。隨后用冷的PBS洗滌，并以2 000 rpm離心10 min以重懸于Binding buffer中。然后加入5 μL膜聯(lián)蛋白V-FITC，在黑暗中孵育15 min。在流式分析之前將5 μL碘化丙啶加入管中。最后，使用BD FACSCalibur流式細胞儀進行流式細胞術(shù)分析，并通過Flowjo軟件進行分析。每個樣品每次含有3個復(fù)孔，結(jié)果來自3次獨立重復(fù)的實驗。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 運用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準差表示，兩組計量資料的比較采用t檢驗，多組計量資料的比較采用單因素方差分析隨后用Tukey分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度PA對HeLa細胞活性的影響

將對照組的細胞活性設(shè)為1，與對照組比較，25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mLPA組Hela細胞的存活率逐漸降低，分別為(0.806±0.056)、(0.582±0.025)、(0.304±0.085)。不同濃度PA組之間Hela細胞的存活率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=98.0，P<0.0001；25 μg/mLvs. control，P=0.0084；50 μg/mLvs. 25 μg/mL，P=0.0035；100 μg/mLvs. 50 μg/mL，P=0.0009)(圖1)，Hela細胞的存活率隨著PA濃度的增加而下降，提示PA對Hela細胞的增殖抑制作用具有藥物劑量依賴性。

圖1 CCK-8方法檢測PA對Hela細胞增殖的影響Figure 1 Cell viability of Hela cells treated with PANote：* P<0.05，when compared with PA at different concentrations.

2.2 PA對HeLa細胞遷移和侵襲能力的影響

用基質(zhì)膠包被的小室進行遷移和侵襲試驗，以研究PA對HeLa細胞遷移和侵襲能力的影響。數(shù)據(jù)顯示，與對照組相比，25 μg/mL PA處理的HeLa細胞其遷移和侵襲能力顯著減弱(F=141.3，P<0.0001；25 μg/mLvs. control，P<0.0001)(圖2A和2B)，且50 μg/mL PA的抑制效果優(yōu)于25 μg/mL(P=0.0171)，100 μg/mL PA的抑制效果優(yōu)于50 μg/mL(P=0.0031)，表明PA抑制Hela細胞的遷移和侵襲能力具有藥物濃度依賴性。

圖2 Transwell實驗觀測各組Hela細胞遷移、侵襲情況Figure 2 The abilities of migration and invasion of Hela cells treated with PANote：A.Migration and invasion of Hela cells after PA treatment；B.The results of statistical analysis(*P<0.05).

2.3 PA對Hela細胞凋亡相關(guān)基因的影響

采用實時熒光定量PCR技術(shù)對對照組和PA處理組的Hela細胞進行凋亡相關(guān)基因的檢測，可見凋亡保護基因Bcl-2在不同濃度的PA作用下均降低，且不同濃度PA組之間的Bcl-2表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=164.5，P<0.0001；25 μg/mLvs. control，P=0.0017；50 μg/mLvs. 25 μg/mL，P=0.0029；100 μg/mLvs. 50 μg/mL，P<0.0001)(圖3A)；凋亡促進基因Bax在不同濃度的PA作用下均升高(F=121.5，P<0.0001；25 μg/mLvs. control，P=0.0100；50 μg/mLvs. 25 μg/mL，P=0.0066；100 μg/mLvs. 50 μg/mL，P<0.0001)，且Cleaved-caspase-3在不同濃度PA組之間的表達差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=425.1，P<0.0001；25 μg/mLvs. control，P<0.0001；50 μg/mLvs. 25 μg/mL，P<0.0001；100 μg/mLvs. 50 μg/mL，P<0.0001)(圖3B和3C)。表明Hela細胞的凋亡水平隨著PA濃度的增加而上升，提示PA對Hela細胞的促凋亡作用具有藥物劑量依賴性。

圖3 qRT-PCR方法檢測HeLa細胞中凋亡相關(guān)基因的表達Figure 3 The expression of apoptosis-related gene in Hela cells treated with PANote：A.The expression of bcl-2 gene in PA groups(*P<0.05)；B.The expression of bax gene in PA groups(*P<0.05)；C.The expression of cleaved-caspase-3 gene in PA groups(*P<0.05).

2.4 PA對HeLa細胞凋亡的影響

為了進一步對PA誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡進行量化，用Annexin Ⅴ-FITC/PI染色細胞，隨后用流式細胞術(shù)分析。PA處理組凋亡細胞的數(shù)量以劑量依賴性方式增加(F=262.6，P<0.0001；25 μg/mLvs. control，P<0.0001；50 μg/mLvs. 25 μg/mL，P<0.0001；100 μg/mLvs. 50 μg/mL，P=0.0064)(圖4A)。凋亡細胞的比例從0.280±0.027(25 μg/mL)增加到0.593±0.043(100 μg/mL)，而未經(jīng)治療的對照組僅為0.010±0.007(圖4B)。表明PA可以明顯增加Hela細胞的凋亡率，且隨著PA濃度的增加而上升。

圖4 流式細胞學(xué)檢測HeLa細胞凋亡情況Figure 4 PA induced apoptosis in Hela cellsNote：A.The distribution of Hela cells treated with PA by flow cytometry；B.The results of statistical analysis(*P<0.05).

3 討論

婦科惡性腫瘤宮頸癌發(fā)病率高、惡性程度大，我國每年約有2萬余名婦女死于宮頸癌[8]。為改善宮頸癌患者預(yù)后，降低放療、化療副反應(yīng)和復(fù)發(fā)率，科研人員不斷的探索研究。PA是16碳長鏈飽和脂肪酸，是棕櫚油中飽和脂肪酸的主要成分[2]，占其總脂肪酸含量的44%～52%[3]，分子式為C16H32O2。它的生物學(xué)和藥理學(xué)活性廣泛，研究顯示其與代謝綜合征、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、炎癥和腫瘤相關(guān)。本研究通過人宮頸癌HeLa細胞為對象，觀察PA對宮頸癌細胞增殖、遷移、侵襲能力和凋亡的影響。CCK-8結(jié)果表明，不同劑量PA(25、50和100 μg/mL)對宮頸癌HeLa細胞增殖有抑制作用，且該抑制作用呈劑量依賴性。遷移侵襲實驗結(jié)果表明，隨著PA濃度的增加，HeLa細胞的遷移和侵襲能力隨之減弱。

細胞凋亡是細胞在基因調(diào)控下，為適應(yīng)外界環(huán)境的影響主動程序死亡的過程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為凋亡細胞變形且體積縮小，貼壁培養(yǎng)細胞會出現(xiàn)變圓、皺縮、脫落，細胞核染色質(zhì)濃縮、邊聚，分割成塊狀和凋亡小體等[9]。大量的研究表明，藥物治療宮頸癌疾病主要是通過誘導(dǎo)其凋亡[10]，其中線粒體凋亡途徑是細胞凋亡最主要的途徑之一，通常凋亡信號能引起線粒體的通透性轉(zhuǎn)換孔(PT)開放，導(dǎo)致線粒體跨膜電位下降[11]。隨著線粒體膜功能障礙，細胞會募集并激活Caspase-3，進而誘發(fā)Caspase家族級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細胞凋亡[12]。氧化應(yīng)激、輻射和抗癌劑可誘導(dǎo)內(nèi)源性信號通路的激活，從而導(dǎo)致Bcl家族表達并干擾線粒體膜電位[13]。在線粒體外膜中，Bcl-2家族蛋白的平衡被認為能夠維持線粒體膜電位和線粒體功能[14]。因此，Bcl家族是內(nèi)在信號傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵指標(biāo)，高Bcl2表達可以避免細胞凋亡。然而，Bax可以幫助內(nèi)在途徑的進展。如本研究的實時熒光定量PRC結(jié)果所示，在用PA處理后，會顯著增加細胞質(zhì)促凋亡Bax和Cleaved-caspase-3基因表達而降低抗凋亡Bcl-2基因水平，破壞線粒體膜電位，進而促進線粒體驅(qū)動的細胞凋亡，表明PA通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡Bcl-2蛋白家族，發(fā)揮其誘導(dǎo)細胞凋亡的作用。另外流式細胞結(jié)果顯示，隨著PA濃度的提高，HeLa細胞的凋亡水平顯著上升。因此，PA可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)在信號傳導(dǎo)通路誘導(dǎo)宮頸癌細胞凋亡并引起線粒體功能障礙。本研究初步驗證了PA對HeLa細胞增殖，遷移、侵襲和凋亡的影響，詳細的分子機制尚需進一步探索。