貝母素甲對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)及自噬的影響

郭蘇蘭 李佳娜 肖水秀

(深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院，廣東 深圳 518110)

缺血性腦血管病(ICVD)是一種比較常見的高致殘性和高致死性的心腦血管疾病，嚴(yán)重危害人類健康。腦組織缺血可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生不可逆的死亡，如發(fā)生腫脹、 裂解、細(xì)胞器游離等病理改變，進(jìn)一步引起細(xì)胞的自噬、凋亡和壞死〔1〕。而腦缺血再灌注損傷(CIRI)是指缺血腦組織恢復(fù)血流后，神經(jīng)細(xì)胞損傷和功能不但沒有恢復(fù)，反而進(jìn)一步加重的現(xiàn)象〔2〕。臨床上常常通過溶栓治療方法防治缺血性腦病，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完成闡明，可能與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡、興奮性氨基酸毒性作用、等氧化應(yīng)激等有關(guān)〔3〕。目前臨床上對(duì)CIRI的防治尚無特效藥物或手段，因此，尋找新的藥物來防治腦缺血再灌注損傷是非常必要的。貝母素甲(PM)為貝母的主要活性成分之一，屬于生物堿類物質(zhì)〔4〕。研究表明〔4〕PM具有明顯的抗炎作用。目前，關(guān)于PM對(duì)CIRI的作用及其機(jī)制未見相關(guān)研究報(bào)道。本研究旨在探討PM是否通過影響CIRI的炎癥反應(yīng)和自噬機(jī)制而起保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康C57BL小鼠144只，SPF級(jí)，雌雄各半，體重18～22 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(粵)2015-0004。

1.2藥物與試劑 PM：阿拉丁試劑有限公司；阿司匹林片(ASA，規(guī)格 0.3 g/片，丹東醫(yī)創(chuàng)藥業(yè)有限責(zé)任公司)；腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒、白細(xì)胞介素(IL)1β ELISA檢測(cè)試劑盒和IL-10 ELISA檢測(cè)試劑盒(博士德生物技術(shù)有限公司)；總蛋白定量測(cè)試盒(南京建成股份有限公司)；尼龍栓線(廣州佳靈生物技術(shù)有限公司)；氯化三苯四氮唑(TTC，Sigma-Aldrich)。小鼠源單克隆LC3-Ⅱ抗體(Nanotools 0231-100/LC3-5F10)，兔單克隆β-arresting抗體(ab32099)(Abcam)，兔單克隆Beclin-1抗體(Cell Signaling Technology)，內(nèi)參照為小鼠源單克隆β-actin抗體(碧云天AA128)。

1.3造模及分組 動(dòng)物按體重隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、ASA組、PM 低、中、高劑量組(PM-L組、PM-M組、PM-H組)各24只。各組于造模前連續(xù)灌胃給藥3 d，ASA組小鼠灌胃給藥2 mg/(kg·d)，PM低、中、高劑量組小鼠分別灌胃給藥1 mg/(kg·d)，2 mg/(kg·d)，4 mg/(kg·d)，假手術(shù)組和模型組小鼠灌胃給予等量生理鹽水。各組小鼠末次給藥3 h后，參照文獻(xiàn)〔5〕方法造模。主要方法如下：2%異戊巴比妥鈉麻醉小鼠，將小鼠仰臥固定于37℃手術(shù)臺(tái)，小心將頸部毛發(fā)剃去，并使用75%酒精消毒剃毛皮膚，頸部正中縱向切開長(zhǎng)約1.5 cm的皮膚，暴露和分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，然后將頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端結(jié)扎，頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端剪一小口，并將尼龍拴線于剪口處插入，輕輕伸入頸內(nèi)動(dòng)脈，微遇阻力后立即停止推進(jìn)，固定栓線。缺血30 min后，小心拔出尼龍拴線，再灌注24 h，建立小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：小鼠清醒后出現(xiàn)同側(cè)Horner征和對(duì)側(cè)上肢重于下肢的癱瘓癥狀。

1.4神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分 按照Longa等〔6〕5分制法對(duì)各組小鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。評(píng)分方法如下：無精神損傷癥狀計(jì)為0分；未能完全伸展對(duì)側(cè)前爪計(jì)為1分;向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈計(jì)為2分；向?qū)?cè)傾倒計(jì)為3分；不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失計(jì)為4分。其中0分視為造模不成功，造模后死亡或昏迷2 h以上小鼠均視為造模失敗，不計(jì)入動(dòng)物結(jié)果。

1.5腦梗死體積測(cè)定 小鼠2%異戊巴比妥鈉麻醉后，并頸椎脫臼處死，開顱小心取腦，使用30 ml生理鹽水分別沖洗3次，將腦組織放于-20℃冰凍30 min，將腦置于腦膜具，分別于額極向枕極行冠狀切片，厚度均為2 mm，共5片，0.5% TTC染液37℃避光孵育30 min，掃描儀掃描，使用Image-Pro Plus圖像分析處理軟件計(jì)算和統(tǒng)計(jì)腦梗死率，其中腦梗死率=梗死面積/總面積×100%。

1.6腦組織形態(tài)學(xué)觀察 4%多聚甲醛固定腦組織，自來水流水浸泡24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，片厚5 μm，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察腦組織海馬齒狀回形態(tài)學(xué)變化。

1.7腦水含量測(cè)定 小鼠開顱取腦后，生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干表面水分，準(zhǔn)確稱量并計(jì)為濕重，然后把腦組織置于105℃恒溫干燥箱干烤72 h，并準(zhǔn)確稱取腦組織計(jì)為干重，腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.8腦組織炎癥因子的測(cè)定 使用玻璃勻漿器，按照1∶9的質(zhì)量體積比〔腦組織(g)∶生理鹽水(ml)〕制備10%腦組織勻漿液，并離心(4℃，3 000 r/min，5 min)取上清液，按照試劑盒操作步驟測(cè)定腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-10。

1.9自噬蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1和β-arrestin的表達(dá)檢測(cè)(Western印跡) 小心分離出缺血側(cè)半球腦皮質(zhì)，加入適量放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液，使用玻璃勻漿器于冰上勻漿，離心(10 000 r /min，4℃，40 min)，取上清即為檢測(cè)樣品。二喹啉甲酸(BCA)法定量檢測(cè)蛋白濃度，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離目的蛋白，濕法轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂牛奶封閉4 h，分別加入一抗β-arrestin (1∶800)，LC3-Ⅱ(1∶200)，Beclin-1(1∶800)和內(nèi)參β-actin(1∶4 000)，4℃過夜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)(ECL)試劑盒顯色檢測(cè)蛋白條帶。以β-actin 灰度值作為內(nèi)參照，采用 quantity one Image J 軟件進(jìn)行圖像灰度值分析。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1行為學(xué)評(píng)分觀察 與假手術(shù)組〔(0.00±0.00)分〕比較，模型組小鼠行為學(xué)分?jǐn)?shù)〔(3.75±0.34)分〕明顯升高(P<0.01)，表現(xiàn)為小鼠向左側(cè)傾倒或旋轉(zhuǎn)，觀察左側(cè)前爪不能完全伸展，甚至不能行走。與模型組比較，ASA組和PM-L、PM-M、PM-H組行為學(xué)分?jǐn)?shù)均明顯降低〔(2.45±0.32)分、(3.12±0.31)分、(2.32±0.25)分、(2.22±0.23)分，P<0.05〕，各給藥組小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)均明顯改善。與PM-L組比較，PM-H組小鼠行為學(xué)分?jǐn)?shù)明顯降低(P<0.05)。

2.2腦梗死體積觀察 與假手術(shù)組〔(0.00±0.00)%〕比較，模型組小鼠腦梗死率顯著升高〔(45.21±4.23)%，P<0.01〕。與模型組比較，ASA組和PM-L、PM-M、PM-H給藥組小鼠腦梗死率明顯降低〔(25.45±3.24)%、(30.54±3.25)%、(23.48±2.16)%、(12.35±1.98)%，P<0.05〕。與PM-L組比較，PM-H組小鼠腦梗死率明顯降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 腦梗死體積觀察(TTC染色)

2.3腦組織海馬齒狀回觀察 假手術(shù)組海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列正常，細(xì)胞層數(shù)多，細(xì)胞飽滿，可見深染的核仁。模型組海馬齒狀回神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞層明顯縮小，排列紊亂，胞質(zhì)濃縮，核固縮。而ASA組和PM給藥組神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況明顯改善，神經(jīng)細(xì)胞層數(shù)較多，排列較整齊。見圖2。

2.4腦水含量觀察 與假手術(shù)組〔(0.10±0.01)%〕比較，模型組小鼠腦組織含水量顯著升高〔(1.31±0.12)%，P<0.01〕。與模型組比較，ASA組和PM-L、PM-M、PM-H給藥組小鼠腦組織含水量明顯降低〔(0.67±0.14)%、(0.18±0.12)%、(0.62±0.15)%、(0.41±0.13)%，P<0.05〕。與PM-L組比較，PM-H組小鼠腦組織含水量明顯降低(P<0.05)。

圖2 腦組織海馬齒狀回觀察(HE，×20)

2.5腦勻漿TNF-α、IL-1β、IL-10含量觀察 模型組小鼠腦勻漿TNF-α和IL-1β含量較假手術(shù)組明顯升高，而IL-10含量明顯降低(P<0.01)。ASA組和PM給藥組小鼠腦勻漿TNF-α和IL-1β含量較模型組明顯降低，而IL-10含量明顯升高(P<0.05，P<0.01)。PM-H組小鼠腦勻漿TNF-α和IL-1β含量明顯較PM-L組明顯降低，而IL-10含量明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠腦勻漿TNF-α、IL-1β、IL-10含量變化

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05,3)P<0.01；與PM-L組比較:4)P<0.05

2.6缺血半暗帶區(qū)LC3-Ⅱ表達(dá)觀察 與假手術(shù)組(0.92±0.05)比較，模型組小鼠缺血半暗帶區(qū)LC3-Ⅱ表達(dá)量明顯降低(0.25±0.02，P<0.01)。與模型組比較，ASA組和PM-L、PM-M、PM-H給藥組小鼠缺血半暗帶區(qū)LC3-Ⅱ表達(dá)量明顯升高(0.53±0.03、0.47±0.04、0.72±0.04、0.84±0.06，P<0.01)。與PM-L組比較，PM-H組小鼠缺血半暗帶區(qū)LC3-Ⅱ表達(dá)量明顯升高(P<0.01)。見圖3。

1～6：假手術(shù)組、模型組、AS組、PM-L組、PM-M組、PM-H組圖3 缺血半暗帶區(qū)LC3-Ⅱ表達(dá)

3 討 論

行為學(xué)評(píng)分和腦梗死率觀察是評(píng)價(jià)模型成功和藥物有效性的直接簡(jiǎn)便的觀察方法。本研究結(jié)果提示PM可明顯改善MCAO行為學(xué)和腦組織的壞死。腦缺血性腦功能障礙的主要原因?yàn)槟X水腫，腦水腫也是腦缺血后最嚴(yán)重的并發(fā)癥，是導(dǎo)致缺血性腦卒中患者死亡的最主要原因之一〔7〕。本研究提示PM可保護(hù)血腦屏障完整性，從而減輕腦水腫。研究發(fā)現(xiàn)〔8,9〕炎癥參與CIRI發(fā)生發(fā)展過程，其中TNF-α和IL-1β是炎癥的兩個(gè)重要因子，參與血腦屏障的通透性和促進(jìn)部分炎性介質(zhì)表達(dá)。發(fā)生時(shí)， TNF-α 可激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，分泌大量 IL-1β，引起一系列的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)〔10〕，而IL-10 是一種抗炎因子，可減輕炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)PM給藥組可明顯抑制炎癥反應(yīng)，從而減輕CIRI。自噬在機(jī)體的生理和病理過程中都能見到，正常機(jī)體中主要通過自噬作用清除胞內(nèi)受損的生物大分子和細(xì)胞器，對(duì)維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和細(xì)胞存活均有重要的意義。已有研究表明CIRI可抑制自噬過程，細(xì)胞過度損傷，進(jìn)一步引起細(xì)胞壞死〔11〕。而LC3-Ⅱ作為自噬水平的一個(gè)標(biāo)志物，常用于反映機(jī)體自噬水平高低的一個(gè)指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)PM給藥組可明顯促進(jìn)自噬，且呈劑量依賴性。