長鏈非編碼RNA核仁小分子RNA宿主基因1對胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響

武秋林 張建

(河南衛(wèi)生干部學(xué)院，河南 鄭州 450008)

胃癌發(fā)病率居于第4位〔1〕，在由癌癥引起的死亡中排名第2，且隨著年齡的增長其發(fā)病率呈上升趨勢，在65歲以上人群中發(fā)病率高達(dá)28.5%〔2〕。由于缺乏有效的早期診斷工具，多數(shù)胃癌患者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)即已處于晚期狀態(tài)，同時伴隨轉(zhuǎn)移發(fā)生，預(yù)后不容樂觀〔3〕。長鏈非編碼(lnc)RNA是一類長度超過200個核苷酸，但無編碼蛋白功能的RNA〔4〕。lncRNA常被認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)錄時的“噪音”，隨著研究的深入，越來越多的研究證實異常表達(dá)的lncRNA和腫瘤的發(fā)生、遷移及預(yù)后密切相關(guān)〔5～7〕。lncRNA參與多種生物功能活動，如細(xì)胞分化、自噬、凋亡等。最新的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在一些惡性腫瘤中異常表達(dá)，甚至可作為原癌基因或抑癌基因而發(fā)揮作用〔8〕。核仁小分子RNA宿主基因(SNHG)1是一種新型的lncRNA，主要定位于細(xì)胞質(zhì)。研究顯示，SNHG1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，在肺癌、肝癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中高表達(dá)并發(fā)揮著潛在的致癌基因角色〔9～11〕。SNHG1在胃癌中的表達(dá)情況及對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響目前仍缺少相關(guān)報道。本研究探討SNHG1在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)情況及對胃癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞系 人胃癌細(xì)胞株SGC7901和BGC823及人正常胃上皮細(xì)胞NGEC購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心。復(fù)蘇SGC7901和NGEC細(xì)胞，采用含10%胎牛血清(FBS)及100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml 鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；復(fù)蘇BGC823細(xì)胞，采用10% FBS及100 U/ml 青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞置于含5%二氧化碳、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中擴(kuò)增培養(yǎng)，生長至培養(yǎng)瓶底面覆蓋率80%～90%(即細(xì)胞處于對數(shù)生長期)時，使用0.25%胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液消化傳代，用于后續(xù)實驗。

1.2主要試劑 RPMI1640、DMEM和無血清培養(yǎng)基(opti-MEM)購于美國Gibco公司，F(xiàn)BS購于美國GIMINI公司；胰酶、青-鏈霉素雙抗購于碧云天生物技術(shù)有限公司；對照序列的小干擾RNA(si-NC)和SNAG1的小干擾RNA(si-SNHG1)等所引物均由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成；Trizol試劑購于美國Invitrogen公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購于美國Applied Biosystems公司；噻唑藍(lán)(MTT)購于Sigma公司；Transwell小室購于BD公司；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和ki67購于美國Affinity公司。蛋白提取試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒及二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購于Thermo公司；β-actin鼠多克隆抗體購于Santa Cruz公司。

1.3胃癌細(xì)胞中SNHG1的敲除 si-SNHG1序列：CUUAAAGUGUUAGCAGACATT；si-NC序列：GCG-ACGAUCUGCCUAAGAUTT。待細(xì)胞生長至融合度約90%時，消化細(xì)胞并計數(shù)，將細(xì)胞分別接種至6孔板，2×105個/孔。每孔加入2 ml含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基過夜。轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行，將lipofectamine 2000和si-RNA分別加入250 μl的opti-MEM中，室溫靜置5 min后，將兩者混在一起并輕輕混勻，室溫靜置20 min形成siRNA/lipofectamine 2000混合物。棄6孔板中的舊培養(yǎng)基，每孔加入1.5 ml的opti-MEM。吸取500 μl siRNA/lipofectamine 2000混合物逐滴加入孔中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4～6 h更換為RPMI1640完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染后續(xù)實驗。

1.4細(xì)胞中RNA的提取 將SGC7901、BGC823和NGEC細(xì)胞分別接種于6孔板中，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2遍。棄凈PBS，每孔加入1 ml TRIZOL試劑，反復(fù)吹吸數(shù)次使細(xì)胞脫落并裂解。將液體收集至無RNA酶的1.5 ml離心管中，室溫放置5 min。加入200 μl氯仿，劇烈晃動15 s，室溫放置3 min。4℃、12 377 r/min離心15 min，將上層水相中的RNA小心吸取轉(zhuǎn)移至另一干凈試管。加入0.5 ml異丙醇，室溫靜置10 min。4℃、12 377 r/min離心10 min后，棄上清，加入1 ml 75%乙醇洗滌沉淀1次，4℃、7 500 r/min離心5 min，棄上清，室溫靜置干燥沉淀，加入50 ml無RNA酶水，55℃水浴10 min使RNA充分溶解。取2 ml液體用紫外分光光度計測定RNA光密度值(OD)，當(dāng)A260/A280比值處于1.8～2.0時，表明RNA純度合適，可進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.5逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 以上提取的RNA按高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Biosystems,Foster City,CA,USA)說明書，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后，以cDNA為模板，用SYBR綠熒光染料法(Biosystems,Foster City,CA,USA)檢測SNHG1表達(dá)水平，SNHG1引物序列為5′-AGGCTGAAGTTACAGGTC-3′(正義)和5′-TTGGCTCCCAGTGTCTTA-3′(反義)。β-actin為內(nèi)參，引物序列為5′-ACCAACTGGGACGAT-3′(正義)和5′-TACGACCAGAGGCATACAGGGACAA-3′(反義)。選擇Ct值處于18～30之間的數(shù)據(jù)，以2-ΔΔCt計算相對表達(dá)量。

1.6MTT法檢測細(xì)胞增殖能力 收獲對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，制備成合適濃度的細(xì)胞懸液，分別接種2 500個/孔于96孔板中，設(shè)置6個復(fù)孔。接種后24 h、48 h、72 h每孔分別加入20 μl 5 mg/ml的MTT，混勻后繼續(xù)孵育4 h。棄掉培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜150 μl/孔，震蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm下檢測每孔OD值。

1.7Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力 收獲轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，用opti-MEM制成濃度為2×105個/200 μl的細(xì)胞懸液。水化Transwell小室后，在小室下部加入500 μl 10%的FBS培養(yǎng)基，上部加入200 μl細(xì)胞懸液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h取出，去除未穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞。室溫下4%多聚甲醛中固定約30 min，隨后置于0.1%結(jié)晶紫溶液中染色30 min。PBS清洗2次，室溫晾干。顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞，每個小室5個視野，取平均值。

1.8Western印跡法檢測增殖和侵襲標(biāo)志蛋白 收獲轉(zhuǎn)染si-SNHG1和si-NC 72 h的細(xì)胞，加入適量RIPA/PMSF裂解液，置于冰上裂解30 min。4℃，12 000 r/min離心15 min，取上清。蛋白上清經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，10%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入1∶1 000鼠抗人β-actin、ki67、MMP-2、MMP-9。4℃孵育過夜，TBST洗膜10 min，共3次。加入1∶2 000稀釋的二抗，37℃孵育約1 h，TBST洗膜3次；ECL發(fā)光檢測，曝光成像。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1SNHG1在胃癌細(xì)胞中表達(dá) SNHG1在NGEC細(xì)胞中的表達(dá)水平(1.00±0.19)顯著低于在SGC7901、BGC823細(xì)胞中的表達(dá)水平(4.16±0.44、6.22±0.65，P<0.05)。

2.2轉(zhuǎn)染si-SNHG1能夠下調(diào)胃癌細(xì)胞SGC7901和BGC823中SNHG1的表達(dá)水平 si-SNHG1轉(zhuǎn)染SGC7901、BGC823細(xì)胞后，SNHG1的表達(dá)量SGC7901細(xì)胞(0.37±0.09)和BGC823細(xì)胞(0.44±0.09)顯著低于空白組(SGC7901細(xì)胞為1.00±0.18，BGC823細(xì)胞為1.00±0.17)及轉(zhuǎn)染si-NC的細(xì)胞(SGC7901細(xì)胞為0.96±0.19，BGC823細(xì)胞為1.01±0.16，P<0.05)。

2.3下調(diào)SNHG1對胃癌細(xì)胞增殖的影響 與si-NC組相比，siSNHG1組SGC7901和BGC823細(xì)胞在48 h、72 h的增殖能力均顯著下降(P<0.05)。見表1。

2.4下調(diào)SNHG1對胃癌細(xì)胞侵襲的影響 si-SNHG1組SGC7901、BGC823細(xì)胞侵襲能力顯著低于si-NC組(P<0.05)，見表1，圖1。

2.5下調(diào)SNHG1對胃癌細(xì)胞增殖和侵襲標(biāo)志蛋白的影響 與si-NC組相比，si-SNHG1組SGC7901、BGC823細(xì)胞的增殖標(biāo)記物ki67和侵襲相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9表達(dá)量均顯著下降。見圖2。

表1 敲除SNHG1對胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

與si-NC組比較：1)P<0.05

圖1 敲除SNHG1抑制SGC7901和BGC823細(xì)胞侵襲(結(jié)晶紫，×100)

圖2 敲除SNHG1抑制SGC7901和BGC823細(xì)胞中Ki67、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)

3 討 論

在哺乳類動物基因組中，無蛋白編碼功能的基因(ncRNAs)約占90%。在這些ncRNAs中約18%的lncRNAs與人類腫瘤疾病有關(guān)，而具有蛋白編碼功能的基因僅占9%〔12〕，表明lncRNAs在人類腫瘤疾病發(fā)生和發(fā)展中扮演重要角色。研究顯示，lncRNAs表達(dá)失調(diào)可對多種腫瘤疾病的進(jìn)程產(chǎn)生影響，如腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移等過程〔13〕。最新研究顯示，lncRNAs SNHG1表達(dá)水平與多個類型腫瘤發(fā)生有關(guān)〔9,11～13〕。lncRNAs SNHG1在腫瘤中表達(dá)上調(diào)往往預(yù)示著病人預(yù)后較差。本研究表明SNHG1在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)且促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

研究表明〔7，10〕，lncRNA參與了基本的生物過程，主要通過與蛋白質(zhì)、DNA或RNA等相互作用發(fā)揮重要的調(diào)控功能，如基因組轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、干擾、核內(nèi)運輸?shù)取Ｑ芯堪l(fā)現(xiàn)lncRNA的正常表達(dá)在個體發(fā)育如胚胎干細(xì)胞干性、細(xì)胞周期等過程中發(fā)揮十分重要的作用，而異常表達(dá)則會導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，影響著腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔14〕。Li等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)lncRNA H19在胃癌中高表達(dá)，并且影響著胃癌細(xì)胞的增殖和遷徙，其機(jī)制可能與H19競爭性結(jié)合其他RNA進(jìn)而發(fā)揮促癌功能。Cui等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，SNHG1通過影響下游基因表達(dá)和信號通路進(jìn)而影響肺癌的進(jìn)展。Sun等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌中SNHG1表達(dá)水平的提高預(yù)示著不良預(yù)后情況，并且SNHG1促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。

MMP與腫瘤血管形成、侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔15〕。MMP2與MMP9主要通過消化基底膜中Ⅳ型膠原纖維從而介導(dǎo)血管侵襲和轉(zhuǎn)移。MMP2可作為胃癌早期診斷標(biāo)志物，MMP9表達(dá)可用于預(yù)測黏膜內(nèi)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。增殖相關(guān)標(biāo)志物Ki67定位于細(xì)胞核、半衰期短，其表達(dá)高低反映了細(xì)胞增殖的程度，是判定腫瘤惡性程度及侵襲力的重要標(biāo)志之一〔16〕。研究證實，ki67在胃癌中的表達(dá)率較高，具有重要的臨床意義〔17〕。本研究顯示，下調(diào)SNHG1表達(dá)，ki67、MMP2和MMP9表達(dá)水平均下降。由此可推斷，SNHG1可能通過影響ki67、MMP2和MM9的表達(dá)在胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

綜上，SNHG1在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲能力密切相關(guān)。降低SNHG1表達(dá)的同時也可降低ki67、MMP2和MMP9的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力降低。