睡眠剝奪對(duì)抑郁癥模型大鼠海馬、前額葉皮質(zhì)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的影響

趙穎琳 許崇濤

(汕頭大學(xué)精神衛(wèi)生中心心身醫(yī)學(xué)科，廣東 汕頭 515061)

抑郁癥是全球性的社會(huì)問題，是最常見的精神障礙之一，世界衛(wèi)生組織現(xiàn)已將其列為醫(yī)療負(fù)擔(dān)最重的疾病〔1〕。多種抗抑郁藥物的研制與使用已幫助抑郁癥患者癥狀大大改善，但這些抗抑郁藥物的使用存在明顯起效遲緩現(xiàn)象，多數(shù)患者需要長時(shí)間用藥并有各種副作用產(chǎn)生，這不僅降低了患者依從性，還提高了抑郁癥自殺率，使藥物治療的安全性與有效性備受質(zhì)疑〔2,3〕。睡眠剝奪是已知的起效最快的抗抑郁治療手段之一，可在24 h內(nèi)發(fā)揮抗抑郁效果，相較于其他任何有效的抗抑郁藥物，其起效時(shí)間顯著縮短，且無明顯副反應(yīng)與禁忌證，安全性好〔4〕。有研究報(bào)道，40%～60%的抑郁癥患者在接受睡眠剝奪治療后，抑郁狀態(tài)得到快速緩解〔5〕。盡管睡眠剝奪產(chǎn)生的抗抑郁效果短暫，限制了其在臨床上的應(yīng)用，但因其為無法耐受抗抑郁藥物毒副作用的抑郁癥患者提供了有效的替代治療，并提高了難治性抑郁癥治療效果，對(duì)推動(dòng)抑郁癥治療的進(jìn)展有著重要意義〔6,7〕。本研究旨在對(duì)比分析抑郁癥大鼠與正常大鼠腦區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)水平表達(dá)的差異，明確BDNF與抑郁癥發(fā)病間聯(lián)系，為抑郁癥的早期診斷與合理治療提供可靠的生物學(xué)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 由中山大學(xué)動(dòng)物中心購入35只成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，均為清潔級(jí)。在實(shí)驗(yàn)開始前將大鼠放在汕頭大學(xué)精神衛(wèi)生中心動(dòng)物房?jī)?nèi)進(jìn)行為期1 w的合籠飼養(yǎng)，5只/籠，鼠籠的體積為70 cm×60 cm×60 cm，對(duì)每只大鼠每日進(jìn)行1次觸摸，每次觸摸時(shí)間約為2 min，確保大鼠對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的操作適應(yīng)。飼養(yǎng)1 w后開始進(jìn)行試驗(yàn)，確保動(dòng)物房?jī)?nèi)通風(fēng)良好，室溫調(diào)整為22℃，保證大鼠的自由光照、進(jìn)食及飲水。

1.2動(dòng)物分組 隨機(jī)分為正常對(duì)照組與應(yīng)激造模組，測(cè)試每只大鼠的自發(fā)活動(dòng)行為。正常對(duì)照組納入5只大鼠，除了開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、蔗糖水消耗實(shí)驗(yàn)與墊料定期更換外，不給予其他外在的刺激。應(yīng)激造模組大鼠在慢性輕度且不可預(yù)見性應(yīng)激刺激后按照自發(fā)行為實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇活動(dòng)量減少至少30%的具有明顯抑郁行為的大鼠納入后序?qū)嶒?yàn)；采用隨機(jī)法再將其分為抑郁模型組、睡眠剝奪組(抑郁模型+72 h快眼動(dòng)睡眠剝奪，使用小平臺(tái)水環(huán)境法保證抑郁模型大鼠無法進(jìn)入自主睡眠狀態(tài))及水環(huán)境對(duì)照組。抑郁模型結(jié)合大平臺(tái)對(duì)照組，使用大平臺(tái)水環(huán)境法設(shè)置作為睡眠剝奪環(huán)境對(duì)照組，裝置與小水平臺(tái)水環(huán)境法基本一致，但平臺(tái)直徑確保為18 cm，以保證抑郁模型大鼠能夠自主睡眠。3組各10只大鼠。

1.3實(shí)驗(yàn)流程 在動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后開始第一次開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)與蔗糖水消耗實(shí)驗(yàn)，將實(shí)驗(yàn)大鼠分組后，給予應(yīng)激造模組大鼠連續(xù)3 w的慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激，隨后正常對(duì)照組與應(yīng)激造模組均接受第二次開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)與蔗糖水消耗實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)與蔗糖水消耗實(shí)驗(yàn)所得的結(jié)果，選擇有明顯抑郁樣行為的大鼠作為成功模型納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分組后，將正常對(duì)照組與抑郁模型組大鼠在第二場(chǎng)開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)及蔗糖水消耗實(shí)驗(yàn)后即刻斷頭取出腦組織，其他2組大鼠繼續(xù)接受72 h快眼動(dòng)睡眠剝奪，72 h后對(duì)這兩大鼠展開第三次開場(chǎng)試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后即刻斷頭并將腦組織取出，使用Western印跡法測(cè)定并對(duì)比各組大鼠海馬區(qū)、前額葉皮質(zhì)BDNF表達(dá)水平。慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激模型建立主要步驟：大鼠行為束縛限制120 min，在4℃的冰水里游泳5 min，禁食1 d，禁水1 d，夾尾1 min，明暗顛倒1 d，傾斜鼠籠45°1 d，潮濕墊料10 h，空瓶放置5 h及40℃高溫下震蕩10 min，隨機(jī)安排上述刺激，實(shí)驗(yàn)持續(xù)21 d，每天給予1種刺激，在實(shí)驗(yàn)中每種刺激至少出現(xiàn)2次，但不可連續(xù)出現(xiàn)，以確保大鼠無法預(yù)料刺激發(fā)生。開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)步驟：使用上海吉良公司提供的DigBehv動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)行為視頻跟蹤分析系統(tǒng)檢測(cè)，保證房間內(nèi)隔音、隔光，有空調(diào)，保證室溫在所需范圍內(nèi)，每只大鼠觀察5 min，將敞箱徹底清潔后再觀察下一只大鼠情況。蔗糖水消耗實(shí)驗(yàn)步驟：在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前首先訓(xùn)練大鼠的適應(yīng)與蔗糖水偏愛，實(shí)驗(yàn)前1個(gè)24 h內(nèi)，同時(shí)將2個(gè)裝有蔗糖水的瓶子放于飼養(yǎng)籠內(nèi)，確保大鼠飲用；第2個(gè)24 h將飼養(yǎng)籠內(nèi)放置一瓶1%蔗糖水，一瓶純凈水，讓大鼠自行飲水；在實(shí)驗(yàn)第3個(gè)24 h內(nèi)先禁食禁水21 h，然后同時(shí)給予大鼠一瓶蔗糖水、一瓶純凈水，在3 h后將水瓶取走并稱重，計(jì)算液體消耗量、蔗糖消耗量與蔗糖水比例。

1.4相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將各組大鼠斷頭處死，開顱，取腦，迅速游離出前額葉皮質(zhì)與左側(cè)海馬，置于-80℃保存待檢，采用Western印跡方法測(cè)定各組大鼠海馬和前額葉皮質(zhì)腦區(qū)BDNF表達(dá)水平。(1)主要儀器與試劑：常州國華電器有限公司提供的SHZ-82型恒溫震蕩器、澳大利亞Tencan公司提供的GENIOS型多功能酶標(biāo)儀、美國Bio-RAD公司提供的電泳槽、轉(zhuǎn)移槽及影像掃描儀、Cell Signaling BDNF抗體試劑盒、上海碧云天生物技術(shù)公司提供β-actin抗體、國產(chǎn)分析純、裂解液蛋白濃度檢測(cè)試劑盒等。(2)蛋白樣品制備：將低溫冰箱內(nèi)海馬與前額葉皮質(zhì)取出置于離心管內(nèi)，根據(jù)1∶10體積比加入裂解液勻漿后置于冰上，重復(fù)碾壓碾碎裂解30 min，高速離心取上清液。取蛋白標(biāo)準(zhǔn)配置液充分溶解配置蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后取適量溶液使用0.9%氯化鈉稀釋，根據(jù)樣品數(shù)量配置工作液，混勻后按照不同比例分別加入標(biāo)準(zhǔn)品孔內(nèi)，同時(shí)補(bǔ)充0.9%氯化鈉至一定量，適當(dāng)加入樣品并稀釋，60℃靜置半小時(shí)，使用多功能酶標(biāo)儀觀察吸光度值，取各組數(shù)據(jù)并制作曲線保存，計(jì)算蛋白濃度。(3)電泳條件：按照樣品濃度計(jì)算溶液體積上樣，取上樣樣品離心后加入上樣緩沖液，上樣前煮沸確保蛋白變性，電泳條件：80 V 15 min，100 V 40 min。(4)轉(zhuǎn)膜：蛋白樣品分離后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入轉(zhuǎn)移緩沖液后降溫，冰浴轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)移60 min，300 mA電流，轉(zhuǎn)移完成后轉(zhuǎn)染，并使用清水將未染色染液沖洗干凈以觀察膜上蛋白。上述步驟結(jié)束后進(jìn)行免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光、顯影、定影及凝膠成像分析。

1.5觀察指標(biāo) (1)對(duì)比正常大鼠與應(yīng)激造模組大鼠應(yīng)激前及應(yīng)激后的自發(fā)活動(dòng)情況，包括總路程、中央路程、周邊路程；(2)抑郁模型大鼠建立成功后，記錄并比較睡眠剝奪前、睡眠剝奪后各組大鼠自發(fā)活動(dòng)情況，包括總路程、中央路程及周邊路程；(3)分別于應(yīng)激前、應(yīng)激后記錄并對(duì)比正常對(duì)照組與應(yīng)激造模組大鼠蔗糖水消耗情況，包括消耗量與消耗百分比；(4)對(duì)比各組大鼠海馬與前額葉皮質(zhì)BDNF表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1自發(fā)活動(dòng)比較 應(yīng)激后，應(yīng)激造模組總路程、中央路程、周邊路程均明顯小于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。睡眠剝奪后，睡眠剝奪組總路程、中央路程、周邊路程均明顯高于水環(huán)境對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.2正常對(duì)照組與應(yīng)激造模組蔗糖水消耗情況比較 應(yīng)激后，應(yīng)激造模組大鼠蔗糖水消耗量、蔗糖水消耗百分比均少于正常對(duì)照組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.3各組大鼠海馬、前額葉皮質(zhì)BDNF表達(dá)水平比較 4組中，睡眠剝奪組海馬、前額葉皮質(zhì)BDNF表達(dá)水平最高，然后由高至低依次為水環(huán)境對(duì)照組、抑郁模型組、正常對(duì)照組，其中，正常對(duì)照組與抑郁模型組比較無顯著差異(P>0.05)，抑郁模型組與水環(huán)境對(duì)照組比較無顯著差異(P>0.05)，其他組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表1 正常對(duì)照組大鼠與應(yīng)激造模組大鼠應(yīng)激前后自發(fā)活動(dòng)比較

與應(yīng)激前比較：1)P<0.05；表2、3同

表2 睡眠剝奪組與水環(huán)境對(duì)照組大鼠睡眠剝奪前后自發(fā)活動(dòng)比較

表3 正常對(duì)照組與應(yīng)激造模組大鼠蔗糖水消耗情況比較

表4 各組大鼠海馬、前額葉皮質(zhì)BDNF表達(dá)水平比較

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.05；與抑郁模型組比較：2)P<0.05；與睡眠剝奪組比較：3)P<0.05

3 討 論

抑郁癥帶來的精神殘疾不僅給患者帶來沉重負(fù)擔(dān)，同時(shí)還會(huì)加重家庭與社會(huì)負(fù)擔(dān)，而患者在疾病支配下出現(xiàn)的自殺、自殘、擴(kuò)大性自殺等暴力行為，更危及社會(huì)公共安全〔8，9〕。一直以來，臨床未停止對(duì)抑郁癥患病機(jī)制的研究，但該病明確的病理機(jī)制仍未有較多收獲，主要認(rèn)為低水平、慢性的、長時(shí)間的應(yīng)激源可能是誘發(fā)抑郁或?qū)е乱钟舨∏榧又氐闹饕蛩?，但該?yīng)激源存在不可預(yù)見性與多變性，故在抑郁癥的預(yù)防與治療方面仍無明顯突破〔10〕。

不可預(yù)見的慢性輕度應(yīng)激抑郁模型是現(xiàn)有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中討論抑郁癥發(fā)病機(jī)制及治療應(yīng)用廣泛的動(dòng)物模型，本研究采用該模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，造成的動(dòng)物抑郁狀態(tài)能夠維持幾個(gè)月，建模高效，與抑郁模型建立要求相符〔11〕。自發(fā)活動(dòng)是動(dòng)物活動(dòng)度及其對(duì)新鮮環(huán)境好奇程度的直觀反映，蔗糖水消耗量及消耗比例則是用于快感缺乏評(píng)價(jià)的客觀指標(biāo)，上述結(jié)果均提示大鼠模型在接受21 d慢性不可預(yù)見應(yīng)激后已經(jīng)出現(xiàn)明顯的抑郁樣行為，對(duì)周圍環(huán)境的興趣喪失且缺乏快感，這與抑郁癥患者表現(xiàn)出的興趣缺乏、心境低落、樂趣喪失等核心癥狀極其相似，可見以該方式創(chuàng)建的抑郁模型有著相當(dāng)高度的有效率。睡眠剝奪能有效改善抑郁情緒，起效迅速是其主要特點(diǎn)，但值得注意的是，該治療方案在結(jié)束后的恢復(fù)性睡眠將會(huì)對(duì)睡眠剝奪抗抑郁效應(yīng)產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)〔12,13〕。一般來說，睡眠剝奪治療時(shí)間多為24 h，但為減少因恢復(fù)性睡眠帶來的抗抑郁逆轉(zhuǎn)效應(yīng)，本研究結(jié)果顯示，睡眠剝奪組大鼠自發(fā)活動(dòng)顯著增加，有接近70%的大鼠其抑郁行為得到顯著改善，提示排除活動(dòng)限制、應(yīng)激、平臺(tái)環(huán)境等因素造成的影響，睡眠剝奪本身可通過延長剝奪時(shí)間逆轉(zhuǎn)大鼠抑郁樣行為。

海馬還是成年大腦內(nèi)細(xì)胞增生與分化的主要腦區(qū)，隨著人們對(duì)情感障礙研究的深入，抑郁癥患病機(jī)制及治療機(jī)制的研究重點(diǎn)現(xiàn)已聚集到腦區(qū)重要組織〔14〕。近年學(xué)者認(rèn)為抑郁癥的發(fā)生發(fā)展可能與因神經(jīng)營養(yǎng)因子水平表達(dá)下降引起神經(jīng)元萎縮，導(dǎo)致海馬神經(jīng)出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞缺失引起，而抗抑郁藥物的使用能夠逆轉(zhuǎn)或阻斷神經(jīng)營養(yǎng)因子缺失，進(jìn)而產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)細(xì)胞萎縮與缺失的效果，進(jìn)一步改善抑郁相關(guān)行為〔15,16〕。在神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的形成及可塑性中，神經(jīng)營養(yǎng)因子起到關(guān)鍵作用，BDNF作為重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一，是目前抑郁癥神經(jīng)營養(yǎng)因子假說研究的焦點(diǎn)，其可經(jīng)與高親和力受體相結(jié)合，對(duì)下游磷脂酰肌醇-3激酶-Akt、Ras-分裂原活化蛋白激酶及其他相關(guān)信號(hào)通路產(chǎn)生激活之效，不僅能加速未成熟神經(jīng)元生長及發(fā)育，還能夠?qū)Τ赡昴X神經(jīng)元的可塑性及結(jié)構(gòu)產(chǎn)生調(diào)節(jié)之效〔16～18〕。本研究結(jié)果，與王建〔19〕的報(bào)道基本一致，提示抑郁癥的產(chǎn)生可能不是BDNF信號(hào)通路單獨(dú)損傷導(dǎo)致，還可能與其他通路損傷有關(guān)，但受研究條件的限制，本此研究并未對(duì)此進(jìn)行分析，還應(yīng)在未來展開相關(guān)的研究加以驗(yàn)證。本研究結(jié)果提示抑郁模型大鼠海馬、前額葉皮質(zhì)BDNF水平升高可能參加了睡眠剝奪迅速抗抑郁的發(fā)生，究其原因，BDNF對(duì)細(xì)胞長期存活有重要作用，對(duì)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放與突觸可塑性均有理想的急性效應(yīng)。上述結(jié)果也從側(cè)面反映了提高抑郁癥患者可塑性相關(guān)蛋白表達(dá)，能夠產(chǎn)生快速抗抑郁之效。本研究結(jié)果提示，抑郁模型大鼠腦內(nèi)BDNF與抑郁癥發(fā)生間并非簡(jiǎn)單因果聯(lián)系， BDNF表達(dá)可能參與了睡眠剝奪快速抗抑郁機(jī)制，但該結(jié)果的真實(shí)性及其發(fā)生的具體機(jī)制仍需要在未來展開相關(guān)研究加以驗(yàn)證。

綜上所述，睡眠剝奪可能通過提高抑郁模型大鼠腦內(nèi)BDNF表達(dá)來促進(jìn)抑郁模型大鼠行為的改善，調(diào)節(jié)腦內(nèi)BDNF表達(dá)在未來可能成為抑郁癥治療的新思路及新靶點(diǎn)。