雛菊葉龍膽酮對小鼠腦缺血損傷模型的影響及機(jī)制

鄭渤 胡慧敏 趙志英 陳彪 李彪 云娜

(1內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2內(nèi)蒙古巴彥淖爾市醫(yī)院麻醉科；3內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院麻醉學(xué)專業(yè)2016級本科生)

缺血性腦血管病是神經(jīng)內(nèi)科常見疾病，且已成為我國國民死亡的首要原因。但目前的臨床治療手段非常有限，有限的時(shí)間窗內(nèi)溶栓及介入治療雖然可以降低死亡率，但腦缺血損傷的藥物治療仍然是目前阻礙治療的世界性難題。龍膽科獐牙菜屬植物，為我國傳統(tǒng)蒙藥藥用植物。研究發(fā)現(xiàn)，龍膽科植物中分離提取得到的化合物——雛菊葉龍膽酮具有廣泛的生物學(xué)活性作用，如抗氧化、抗菌、抑制膽堿酯酶及單胺氧化酶、保護(hù)心血管系統(tǒng)等〔1,2〕。本課題組前期研究從內(nèi)蒙古道地藥材尖葉假龍膽(蒙藥名：阿古特-其其格)中分離提取出雛菊葉龍膽酮(Bellidifolin)，并發(fā)現(xiàn)具有一定的抗腦缺血作用，其作用機(jī)制可能與通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和抑制興奮性氨基酸產(chǎn)生、提高腦組織γ-氨基丁酸(GABA)含量有關(guān)〔3〕。本研究擬通過結(jié)扎小鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈的方法復(fù)制動(dòng)物腦缺血損傷模型，探究雛菊葉龍膽酮對缺血性腦損傷的保護(hù)作用及其作用的信號通路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 3月齡健康雄性C57BL小鼠30只，由內(nèi)蒙古科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，Scxk(蒙)2016-0001。雛菊葉龍膽酮購自四川維克奇生物科技有限公司(純度均≥98%)，兔抗細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、氨基末端激酶(JNK)、p-38MAPK、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3購自CST公司。 體重(25.7±1.5)g，按照隨機(jī)數(shù)字表將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(C)組、腦缺血損傷(AD)組、 雛菊葉龍膽酮高劑量組(100 mg/kg，H組)、中劑量組(75 mg/kg,I組)、低劑量組(50 mg/kg,L組)，每組6只。

1.2腦缺血模型的建立 將小鼠用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的水合氯醛(1 ml/100 g)腹腔麻醉后，仰臥固定于操作臺上，備皮、消毒后于頸前正中部位做一個(gè)1～2 cm的矢狀切口，氣管兩側(cè)分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈、迷走神經(jīng)，動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，觀察小鼠的瞳孔大小和翻正反射。腦缺血模型制作成功的標(biāo)準(zhǔn)是夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈2 h后雖正反射消失，雙側(cè)瞳孔放大但可以自主呼吸。實(shí)驗(yàn)過程中小鼠出現(xiàn)抽搐癥狀或小鼠死亡即建立模型失敗。

1.3Western印跡檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 小鼠麻醉后，斷頭取腦，冰上分離雙側(cè)腦皮質(zhì)、海馬備用。分離腦組織并超聲粉碎，提取蛋白，并用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測定蛋白濃度。瓊脂糖凝膠電泳后運(yùn)用ImageJ圖像分析軟件測得條帶灰度值，將各目的條帶與內(nèi)參條帶比值后，比較各組間差異。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組腦組織caspase-3蛋白表達(dá)水平比較 與C組(0.365±0.018)比較，AD組缺血側(cè)腦組織caspase-3蛋白表達(dá)水平(0.843±0.051)顯著增加(P<0.05)；L組、I組、H組(0.805±0.023、0.674±0.053、0.313±0.009)顯著低于AD組(P<0.05)，且與劑量呈相關(guān)性，見圖1。

2.2各組腦組織p38MAPK蛋白表達(dá)水平 與C組(0.412±0.015)比較，AD組缺血側(cè)腦組織p38MAPK蛋白表達(dá)水平(1.179±0.102)顯著增加(P<0.05)；L組、I組、H組(0.871±0.031、0.762±0.101、0.631±0.017)顯著低于AD組(P<0.05)，且與劑量呈相關(guān)性。見圖2。

圖1 各組腦組織caspase-3蛋白表達(dá)

圖2 各組腦組織p-p38MAPK蛋白表達(dá)

2.3各組腦組織p-JNK蛋白表達(dá)水平 與C組(0.447±0.059)比較，AD組缺血側(cè)腦組織p-JNK蛋白表達(dá)水平(1.151±0.071)顯著增加(P<0.05)；L組、I組、H組(0.100±0.011、1.010±0.052、0.712±0.102)顯著低于AD組(P<0.05)，且與劑量呈相關(guān)性。見圖3。

圖3 各組腦組織p-JNK蛋白表達(dá)

2.4各組腦組織p-ERK蛋白表達(dá)水平 與C組比較，AD組腦組織p-ERK表達(dá)變化不明顯。見圖4。

圖4 各組腦組織p-ERK蛋白表達(dá)

3 討 論

腦缺血損傷是由于一系列復(fù)雜的生化和分子機(jī)制如促凋亡蛋白和促炎細(xì)胞因子等因素導(dǎo)致的大腦、小腦及腦干等局部或多部位缺血，進(jìn)而引起相關(guān)神經(jīng)功能異常的疾病〔4〕。由于腦血管疾病具有高發(fā)病率、高致殘率及高死亡率等特點(diǎn)，已成為中老年患者獲得最佳療效的主要難題〔5〕。雖然目前臨床應(yīng)用的西醫(yī)手段如介入治療等效果顯著，但術(shù)后不良反應(yīng)、高額的手術(shù)費(fèi)用及可能的二次灌注損傷都是亟待解決的問題。中藥有效成分由于其作用明顯，安全性高，臨床療效顯著，通過多途徑發(fā)揮作用而成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)和前沿〔6，7〕。

體外實(shí)驗(yàn)表明，雛菊葉龍膽酮對低氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，雛菊葉龍膽酮抑制細(xì)胞凋亡，機(jī)制是通過抑制p38MAPK信號通路激活下游caspase-3、提高Bcl-2/Bax的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)〔7〕。雛菊葉龍膽酮又名雛菊葉龍膽素，主要存在于龍膽科獐牙菜屬、假龍膽屬、龍膽屬植物中〔8〕。研究表明，雛菊葉龍膽酮具有多種生物學(xué)活性，高佳琪〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，雛菊葉龍膽酮可改善糖代謝促進(jìn)糖消耗，發(fā)揮降血糖作用，其機(jī)制可能是雛菊葉龍膽酮參與調(diào)控胰島素的基因表達(dá)，影響相關(guān)蛋白的磷酸化水平及蛋白表達(dá)水平。有研究表明，雛菊葉龍膽酮可能通過減輕氧化應(yīng)激水平，發(fā)揮對胰島的保護(hù)作用〔10〕。雛菊葉龍膽酮可以在人體內(nèi)的內(nèi)皮轉(zhuǎn)化過程中對過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮保護(hù)作用〔11〕。雛菊葉龍膽酮參與神經(jīng)損傷后的修復(fù)，雛菊葉龍膽酮可促進(jìn)坐骨神經(jīng)損傷后功能恢復(fù)，可促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)〔12〕。

MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以參與調(diào)控多種細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)，尤其是在細(xì)胞增殖、分化及凋亡過程中，是多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的共同作用部位。MAPK被激活后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，使一些轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生磷酸化，改變細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的狀態(tài)。有研究認(rèn)為ERK通路的激活主要是促進(jìn)細(xì)胞存活和抑制凋亡，而JNK和p-38MAPK通路的激活主要與細(xì)胞凋亡有關(guān)〔13〕。p-38MAPK已被證明可以通過激活其下游的激酶和轉(zhuǎn)錄因子，加速細(xì)胞凋亡，造成腦缺血損傷的進(jìn)一步發(fā)展〔14〕?；罨腏NK參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖分化、凋亡、胚胎發(fā)育、癌基因的轉(zhuǎn)化等多種生命過程，JNK代表了保護(hù)腦免受缺血性腦卒中的治療靶點(diǎn)〔15〕。本課題組前期研究表明，雛菊葉龍膽酮可有效抑制低氧所致的PC12細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制p-38MAPK信號通路的活化及下游caspase-3的表達(dá)有關(guān)〔16〕。本研究發(fā)現(xiàn)，雛菊葉龍膽酮可以下調(diào)p-38MAPK、p-JNK的表達(dá)，進(jìn)而降低腦缺血引起的caspase-3表達(dá)升高，抑制腦組織細(xì)胞凋亡。再次證明雛菊葉龍膽酮具有一定的抗腦缺血作用，其通過影響MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與對缺血損傷細(xì)胞凋亡程度的調(diào)控。