壯藥龍鉆通痹方影響類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Smad5的時(shí)序性分析

田照 龐宇舟 袁德培 方剛 張曼 王文晟 余遠(yuǎn)鵬

(1湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 恩施 445000；2廣西中醫(yī)藥大學(xué)壯醫(yī)藥學(xué)院)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種好發(fā)于中年肥胖女性及老年群體的自身免疫性疾病，以小關(guān)節(jié)對(duì)稱(chēng)性炎癥和骨質(zhì)進(jìn)行性破壞為主要特征〔1〕。在北歐及北美地區(qū)RA患病率為0.5%～1.0%，中國(guó)地區(qū)約為0.42%，隨著人口老齡化加劇及死亡率下降，預(yù)計(jì)本病的患病率將會(huì)繼續(xù)提高〔2,3〕?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療RA以改善病情的抗風(fēng)濕病藥(DMARDs)為主，聯(lián)合皮質(zhì)類(lèi)固醇、生物制劑或化學(xué)合成劑等〔4〕。上述方法通常可取得較好的療效，能夠延緩病情進(jìn)展，但治療期間的一些副作用如肝損害、骨髓抑制等也不容忽視。故探索療效可靠且副作用小的替代藥物或輔助療法一直是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界努力的方向。

龍鉆通痹方由飛龍掌血、大鉆、兩面針、五指毛桃根、八角楓、雞血藤、青風(fēng)藤、九龍?zhí)侔宋秹阉帢?gòu)成。前期研究證實(shí)本方可降低患者紅細(xì)胞沉降率，改善關(guān)節(jié)疼痛麻木，縮短晨僵時(shí)間，有助于延緩病情，降低致殘率〔5〕。其作用機(jī)制可能與調(diào)控Toll樣受體(TLR)4/核因子(NF)-κB信號(hào)通路，降低白介素(IL)-6等炎癥因子及TLR4、髓樣分化因子(MYD)88基因表達(dá)有關(guān)〔6〕。同時(shí)，研究顯示龍鉆通痹方干預(yù)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CIA)模型大鼠可減少滑膜組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，下調(diào)大鼠血清和滑膜勻漿液中死亡受體Fas表達(dá)，同時(shí)提高死亡受體配體FasL的表達(dá)水平。故推測(cè)龍鉆通痹方治療RA可能也與調(diào)控Fas/FasL系統(tǒng)有關(guān)〔7〕。

RA的致畸致殘與骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡有密切關(guān)系，骨基質(zhì)不斷被破骨細(xì)胞吸收，隨后由成骨細(xì)胞替代形成新骨，由此形成骨重建進(jìn)而達(dá)到骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡〔8,9〕。成骨細(xì)胞是維持骨骼結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)骨微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵，已有研究證實(shí)，Smad5是成骨細(xì)胞分化調(diào)控通路骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)/Smads的重要調(diào)節(jié)因子之一，在促進(jìn)骨祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化及維持骨穩(wěn)態(tài)方面起著非常關(guān)鍵的作用〔10,11〕。在關(guān)節(jié)炎條件下，Smad5表達(dá)降低，成骨細(xì)胞分化信號(hào)亦隨之減弱，致使骨礦化失常、骨質(zhì)丟失、關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨逐漸遭受破壞〔12〕。故促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、增加骨細(xì)胞基數(shù)，對(duì)維持骨的正常結(jié)構(gòu)及最終防止RA致殘具有重大意義。本研究擬探討龍鉆通痹方對(duì)成骨細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子Smad5的影響及時(shí)序性關(guān)系。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 雄性SPF級(jí)SD大鼠96只，體重180～220 g(湖南斯萊克景達(dá)，SCXK(湘)2016-002)。龍鉆通痹方(顆粒劑)，批號(hào)20180508。

大鼠Smad5酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(武漢華美生物工程)；Smad5抗體、弗氏完全佐劑(美國(guó)Sigma)；三氯甲烷、異丙醇(成都科隆)等。

智能熱板儀(成都盟泰，RB-200)；全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(瑞士羅氏，Light Cycler96)；多功能酶標(biāo)儀(瑞士TEACAN ，M200)；高速冷凍離心機(jī)(Sigma，3K15)；研究型倒置顯微鏡(德國(guó)萊卡，DM18)等。

1.2模型制備 將96只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后隨機(jī)分為正常組、模型組、西藥組、壯藥組，每組24只，每組分為四個(gè)亞組，分別是7、14、21、28 d亞組。除正常組外，參照文獻(xiàn)〔13〕中所述方法制備佐劑性RA大鼠模型，即在大鼠右后足底注射弗氏完全佐劑0.15 ml，1 w后在其尾根部再次注射0.1 ml。壯藥組灌胃龍鉆通痹顆粒溶液〔0.54 g/(100 g·d)〕，西藥組灌胃甲氨蝶呤(2.7 mg/kg)，正常組、模型組分別灌胃等體積蒸餾水，灌胃總時(shí)間為21 d，分別在第7、14、21天進(jìn)行前3次取材，停藥1 w后，第4次取材。所取組織為全血、膝關(guān)節(jié)軟骨及右后踝關(guān)節(jié)以下骨組織。造模期間無(wú)動(dòng)物死亡，全部納入數(shù)據(jù)分析。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1RA模型大鼠形態(tài)指標(biāo)觀察

1.3.1.1RA大鼠足底熱板痛閾值檢測(cè) 每只大鼠測(cè)試前在熱板儀中適應(yīng)性活動(dòng)5 min，然后打開(kāi)熱板儀，恒溫50℃，記錄大鼠第一次舔后足的熱痛時(shí)間，每只大鼠檢測(cè)3次，取平均值。

1.3.1.2RA大鼠關(guān)節(jié)腫脹度檢測(cè) 以游標(biāo)卡尺測(cè)大鼠造模前后右后足的腫脹度，造模前1 d測(cè)量1次；造模后給藥第7、14、21天，停藥1 w后的第28天分別測(cè)量1次。公式：腫脹度=(注射后足跖厚度-注射前足跖厚度)/注射前足跖厚度。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量(RT)-PCR檢測(cè)RA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Smad5 mRNA表達(dá) 液氮研磨關(guān)節(jié)軟骨，提取總RNA，測(cè)定總RNA濃度，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反應(yīng)條件為42℃15 min，95℃3 min。Smad5(目的基因)引物委托上海生工生物工程有限公司合成，上游引物：5'-TACCTCCAGTGTTAGTGCCTCGTC-3'，下游引物：5'-GTGCGGCTCATTGTGGCTCAT-3'；內(nèi)參GAPDH上游引物：5'-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3'，下游引物：5'-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'。按擴(kuò)增試劑盒配制擴(kuò)增體系(20 μl)，采用兩步法擴(kuò)增，總共40個(gè)循環(huán)。

1.3.3Western印跡檢測(cè)RA大鼠關(guān)節(jié)軟骨Smad5蛋白表達(dá) 從-80℃冰箱取出關(guān)節(jié)軟骨，液氮中研磨提取蛋白，測(cè)蛋白濃度，制備8%的分離膠及5%的濃縮膠，80 V壓縮濃縮膠，120 V電泳至條帶到底，275 mA轉(zhuǎn)模60 min，TBST洗膜3次，隨后封閉60 min。 Smad5、內(nèi)參GAPDH、一抗、二抗均按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋?zhuān)?4℃孵育一抗過(guò)夜，第2天TBST洗膜后室溫孵育二抗60 min，最后配A、B發(fā)光液顯影。

1.3.4ELISA檢測(cè)RA大鼠血清Smad5蛋白含量 從-80℃冰箱取出已分裝好的血清，嚴(yán)格按照試劑盒步驟操作。

1.3.5大鼠踝關(guān)節(jié)形態(tài)學(xué)檢測(cè) 常規(guī)石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察踝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)病理改變。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件,計(jì)量資料組間對(duì)比行單因素方差分析，兩兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1龍鉆通痹方對(duì)RA大鼠足底熱板痛閾值的影響 與正常組比較，其余各組足底痛覺(jué)敏感，閾值時(shí)間短(P<0.05)；與模型組相比，壯藥組與西藥組在第7、14、21、28天痛閾值均明顯高于模型組(P<0.05)，相比其他時(shí)間段，第21天時(shí)段與正常組略接近，但也有顯著差異(P<0.05)，說(shuō)明痛閾值與其給藥時(shí)間有一定關(guān)連性。與西藥組相比，壯藥組未見(jiàn)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組足底熱板痛閾值比較

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

2.2龍鉆通痹方對(duì)RA大鼠足跖關(guān)節(jié)腫脹度的影響 與正常組比較，其余各組關(guān)節(jié)腫脹明顯(P<0.05)；與模型組比較，壯藥組與西藥組在給藥14 d后腫脹度均明顯下降，在21 d腫脹下降最明顯(均P<0.05)；與西藥組比較，壯藥組未見(jiàn)顯著性差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3龍鉆通痹方對(duì)RA大鼠關(guān)節(jié)軟骨Smad5 mRNA表達(dá)的影響 與正常組比較，除21 d時(shí)段壯藥組與西藥組Smad5 mRNA表達(dá)接近于正常組(P>0.05)。以外，其余各組各時(shí)段Smad5 mRNA表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第14～28天，壯藥組、西藥組Samd 5 mRNA表達(dá)明顯高于模型組(P<0.05)，壯藥組與西藥組間比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表3。

2.4龍鉆通痹方對(duì)RA大鼠關(guān)節(jié)軟骨Smad5蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組各時(shí)間段Smad5蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)；壯藥組與西藥組在21 d時(shí)段Smad5蛋白表達(dá)最高，但仍明顯低于正常組(P<0.05)；與模型組比較，壯藥組、西藥組第14天開(kāi)始明顯上調(diào)(P<0.05)。壯藥組與西藥組無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)圖1，表4。

表2 各組足跖腫脹度檢測(cè)

表3 各組關(guān)節(jié)軟骨Smad5 mRNA時(shí)序性比較

圖1 各組大鼠Smad5蛋白的組間及時(shí)序性表達(dá)

組別7 d14 d21 d28 d壯藥組0.56±0.051)0.75±0.101)2)0.93±0.031)2)0.77±0.081)2)西藥組0.51±0.031)0.86±0.081)2)0.98±0.081)2)0.80±0.061)2) 模型組0.42±0.081)0.44±0.071)0.43±0.051)0.46±0.071) 正常組1.13±0.131.17±0.201.05±0.191.14±0.15

2.5龍鉆通痹方對(duì)RA大鼠血清Smad5蛋白含量的影響 與正常組比較，其余各組各時(shí)間段Smad5蛋白含量均明顯下調(diào)(P<0.05)，21 d時(shí)段壯藥組與西藥組Smad5蛋白含量略接近于正常組，但差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，壯藥組與西藥組在給藥21 d開(kāi)始Smad5蛋白含量明顯上調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)表5。

2.6龍鉆通痹方對(duì)RA大鼠病理學(xué)形態(tài)變化的影響 正常組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜光滑無(wú)增生，層次清晰，軟骨細(xì)胞分布規(guī)律，未見(jiàn)炎癥浸潤(rùn)(圖2A)。與正常組比較，模型組滑膜表面增生明顯，關(guān)節(jié)腔變窄(圖2B)，見(jiàn)炎性滲出伴大量淋巴細(xì)胞分布(圖2C)，圖2C為圖2B黑色星號(hào)處高倍鏡下展示。與模型組比較，壯藥組灌胃7 d后仍可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞，軟骨細(xì)胞分布較少(圖2D)；14 d后可見(jiàn)炎性浸潤(rùn)減少，滑膜表面較光滑(圖2E)；21 d后軟骨細(xì)胞排列整齊，淋巴細(xì)胞減少(圖2F)。西藥組給藥7 d后關(guān)節(jié)滑膜仍可見(jiàn)大量炎性滲出和淋巴細(xì)胞，關(guān)節(jié)腔狹窄，滑膜層次不清晰(圖2G)；14 d后見(jiàn)炎癥細(xì)胞減少，軟骨細(xì)胞增多，排列較整齊(圖2H)；給藥21 d后關(guān)節(jié)腔清晰，炎性滲出不明顯，滑膜層次減少，表面光滑(圖2I)。

表5 各組血清Smad5蛋白時(shí)序性比較

圖2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)HE染色比較(×100)

3 討 論

RA是以滑膜異常增殖，血管翳形成，軟骨破壞及鈣流失為其主要病理改變的全身性炎癥性疾病〔14〕。隨著病情加劇，患者小關(guān)節(jié)易致畸致殘，喪失勞動(dòng)力，嚴(yán)重影響患者心理健康及生活質(zhì)量，加重經(jīng)濟(jì)成本和社會(huì)負(fù)擔(dān)〔15〕。所以，如何防治RA，延緩病程及防止致畸致殘已是世界級(jí)醫(yī)學(xué)難題。由于RA的軟骨破壞與成骨細(xì)胞分化程度密切相關(guān)，故探索與成骨細(xì)胞分化的通路調(diào)控因子也是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)話(huà)題。

越來(lái)越多的傳統(tǒng)中藥已被發(fā)現(xiàn)對(duì)下調(diào)骨吸收促進(jìn)因子及上調(diào)骨保護(hù)因子進(jìn)而維持破骨-成骨平衡具有重要作用，民族醫(yī)藥中的壯醫(yī)熱敏探穴針刺療法，藏醫(yī)內(nèi)服外浴結(jié)合法等在治療RA的過(guò)程中都取得了較好的療效〔16～19〕。故在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域積極尋找較好的RA治療方法前景廣闊。已有研究顯示，Smad5是成骨細(xì)胞分化BMP/Smad通路中不可缺失的一環(huán)，Smad5表達(dá)升高可提高骨祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)化率，有利于新骨的形成〔20〕。龍鉆通痹方主藥為飛龍掌血和大鉆，飛龍掌血主要化學(xué)成分為生物堿、香豆素、黃酮等，用其提取物干預(yù)RA小鼠模型，可減輕爪和關(guān)節(jié)腫脹度，使關(guān)節(jié)骨和軟骨遭受破壞的程度明顯低于對(duì)照組〔21,22〕；大鉆具有抗炎、抗氧化、提高免疫力等作用，對(duì)風(fēng)濕性疾病引發(fā)的痛癥效果顯著〔23〕。

本研究西藥組Smad5 mRNA及蛋白表達(dá)略高于壯藥組，可能與RA的頑固性有關(guān)。在沒(méi)有西藥干預(yù)的條件下，傳統(tǒng)方式需要多途徑多療法予以治療；而西藥對(duì)比傳統(tǒng)藥物來(lái)說(shuō)起效時(shí)間相對(duì)較快。本研究認(rèn)為龍鉆通痹方干預(yù)佐劑性RA模型大鼠的起效時(shí)間可能從1 w后開(kāi)始，在14～21 d時(shí)間段達(dá)到效應(yīng)峰值。由于未在RA患者群中做時(shí)序性研究，后期將結(jié)合臨床予以完善，為RA防治策略提供理論支撐。