CYP2C19基因多態(tài)性與缺血性腦卒中發(fā)病及預(yù)后的相關(guān)性

嚴(yán)駿 翁方中 戴偉 周瑞祥 胡朝梁

(武漢市第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖北 武漢 430022)

缺血性腦卒中(ISS)是一組以腦組織缺血性損傷為主要臨床表現(xiàn)的急性腦血管疾病，具有發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高及復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年約有200萬(wàn)新發(fā)腦卒中病例，其中ISS占70%～80%〔1〕。ISS的發(fā)病受飲食、環(huán)境、遺傳等多種因素交互影響近年對(duì)ISS遺傳易感基因的研究成為熱點(diǎn)。細(xì)胞色素P450 藥物代謝酶(CYP)2C19活性存在較大的種族及個(gè)體差異，這種差異主要由遺傳多態(tài)性導(dǎo)致。G681A、G636A是CYP2C19基因的主要突變體，有研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C19 G681A、G636A單核苷酸多態(tài)性可增加心血管事件的發(fā)生率，并與心血管不良預(yù)后相關(guān)〔2〕，但其與ISS發(fā)生的關(guān)系目前少有報(bào)道?？寡“寰奂荌SS治療的主要手段，國(guó)內(nèi)外腦卒中防治指南中均將阿司匹林和(或)氯吡格雷推薦為ISS的一、二級(jí)防治藥物。但是阿司匹林與氯吡格雷對(duì)于血小板活性的抑制作用存在較大的個(gè)體差異。有研究報(bào)道，分別有15%～48%、17%～39%的ISS患者存在阿司匹林與氯吡格雷抵抗現(xiàn)象〔3〕?？寡“寰奂幬锏拇x受CYP2C19活性的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C19基因多態(tài)性導(dǎo)致不同人群及個(gè)體對(duì)抗血小板藥物的代謝能力不同，進(jìn)而出現(xiàn)不同的治療效果〔4〕。本研究檢測(cè)120例老年ISS患者與120例健康體檢者CYP2C19基因表達(dá)情況，分析CYP2C19基因多態(tài)性與ISS發(fā)生、抗血小板藥物代謝及預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1臨床資料 將2014年1月至2016年6月本武漢市第一醫(yī)收治的老年ISS患者120例作為ISS組，男69例，女51例；年齡60～76〔平均(64.56±3.21)〕歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2014》中ISS診斷標(biāo)準(zhǔn)〔5〕，并經(jīng)頭顱計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)或磁共振成像(MRI)檢查確診；②首次發(fā)病，且發(fā)病時(shí)間在12 h內(nèi)入院；③年齡>60歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①凝血功能障礙，血小板計(jì)數(shù)<100×109/L或>450×109/L；②腦腫瘤、腦出血、顱內(nèi)感染、腦梗死后合并出血、短暫性腦缺血發(fā)作；③嚴(yán)重心、肝、腎疾病，惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病；④近2 w內(nèi)使用其他抗血小板聚集藥物、抗凝藥物、溶栓類(lèi)藥物或其他非甾體類(lèi)抗炎藥、質(zhì)子泵抑制劑者；④對(duì)本研究所使用藥物過(guò)敏者。另選取同期健康體檢者120例作為對(duì)照組，男70例，女50例；年齡60～78〔平均(65.02±4.02)〕歲，兩組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2主要試劑與儀器 人血細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒、2倍Taq預(yù)混液10 μl為上海百奧生物科技公司生產(chǎn)，限制性?xún)?nèi)切酶SmaⅠ、BamHI為北京紐英倫生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，瓊脂糖為上海博亞生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。Roche LightCycler?480Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)Roche公司生產(chǎn)，Bio-Rad Power PAC300電泳儀為美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)，UVPGDS-8000凝膠成像分析儀為美國(guó)UVP公司生產(chǎn)。

1.3治療方法 ISS組患者入組后均依據(jù)《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2014》對(duì)癥治療，并給予氯吡格雷〔賽諾菲(杭州)制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字J20080090，規(guī)格：75 mg/片，7片/盒〕75 mg/d口服，持續(xù)治療12個(gè)月。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1基線資料 收集ISS組人口學(xué)特征(性別、年齡、體重指數(shù)、吸煙史、飲酒史等)，既往史(高血壓、糖尿病、心肌梗死、高脂血癥等)，腦卒中TOAST分型(大動(dòng)脈粥樣硬化型、心源性腦栓塞型、小動(dòng)脈閉塞型、其他)，藥物治療(降壓藥、降糖藥、他汀類(lèi)藥物、其他抗血小板聚集藥物)，入院時(shí)治療美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院腦卒中量表(NIHSS)評(píng)分。

1.4.2血小板聚集抑制率檢測(cè) ISS組治療第7天采集空腹靜脈血4 ml，分別裝于肝素抗凝管和檸檬酸抗凝管，2 h內(nèi)采用TEG5000血栓彈力圖儀(美國(guó)Haemoscope公司生產(chǎn))檢測(cè)二磷酸腺苷誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率。血小板聚集抑制率>40%為氯吡格雷敏感，≤40%為氯吡格雷抵抗。

1.4.3預(yù)后 治療6個(gè)月后采用改良Rankin量表(mRS)〔6〕評(píng)價(jià)神經(jīng)功能恢復(fù)情況，mRS評(píng)分0～6分，0分為完全沒(méi)有癥狀，6分為死亡。mRS≤2分為預(yù)后良好，mRS≥3分為預(yù)后不良。

1.4.4CYP2C19基因型檢測(cè) 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性法(PCR-RFLP)進(jìn)行CYP2C19基因型檢測(cè)。受試者采集肘正中靜脈血2 ml，置于EDTA真空抗凝管中，-20℃保存，待測(cè)。按照人血細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明提取DNA。根據(jù)美國(guó)Sequenom公司報(bào)道的序列合成CYP2C19基因引物，基因型為G681A、G636A，由華大基因公司合成，引物序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μl)：2倍預(yù)混合液10 μl，上、下游引物各0.5 μl，DNA模板3 μl，蒸餾水6 μl，Taq酶0.25 μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s；60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)35次，72℃ 終末延伸10 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl進(jìn)行SmaⅠ、BamHI限制性?xún)?nèi)切酶酶切后，進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析儀下觀察結(jié)果，主要檢測(cè)基因分型為野生型(GG)、突變雜合型(AG)和突變純合型(AA)，攜帶野生型(GG)基因者為快代謝型，突變雜合型(AG)為中間代謝型，突變純合型(AA)為慢代謝型。PCR產(chǎn)物送華大基因公司合成進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與美國(guó)Sequenom公司的序列進(jìn)行對(duì)比分析。

表1 CYP2C19基因 G681A型、G636A型引物序列

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t、χ2或Fisher確切概率法檢驗(yàn)，各基因型頻率進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡驗(yàn)證，對(duì)預(yù)后的影響因素進(jìn)行非條件多元Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn) CYP2C19 G681A和G636A在ISS組(χ2=1.380、1.290，P=0.240、0.256)、對(duì)照組(χ2=0.265、0.405，P=0.607、0.525)中的分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律，具有群體代表性，見(jiàn)表2。

表2 ISS組與對(duì)照組CYP2C19 基因分布〔n(%),n=120〕

2.2CYP2C19基因多態(tài)性分析 CYP2C19 G681A的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度192 bp，CYP2C19 G636A的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為234 bp。 CYP2C19 G681A經(jīng)SmaⅠ酶切后，GG型2條帶(111 bp、81 bp)，AG型3條帶(192 bp、111 bp、81 bp)，AA型1條帶(192 bp)，見(jiàn)圖1。CYP2C19 G636A經(jīng)BamHI酶切后，GG型2條帶(135 bp、99 bp)，AG型3條帶(234 bp、135 bp、99 bp)，AA型1條帶(234 bp)，見(jiàn)圖2。

M:DL 2000 Marker；2：AA，5、6：GG，1、3、4：AG圖1 PCR-SmaⅠ酶切的CYP2C19基因G681A位點(diǎn)基因分型

M:DL 2000 Marker；1、3、4、7：AG，2：AA，5、6、8：GG圖2 PCR-BamHI酶切的CYP2C19 G636A位點(diǎn)基因分型

2.3CYP2C19 G681A和G636A位點(diǎn)基因分型頻數(shù)分布 ISS組CYP2C19 G681A位點(diǎn)AA型基因、G636A位點(diǎn)AA型、AG型基因頻率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.4CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷抵抗的相關(guān)性 ISS組中檢出氯吡格雷敏感82例，氯吡格雷抵抗38例。氯吡格雷抵抗組CYP2C19 基因G681A位點(diǎn)AG型、AA型頻率顯著高于敏感組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

2.5影響預(yù)后的單因素分析 ISS組經(jīng)治療后預(yù)后良好79例，預(yù)后不良41例，預(yù)后不良組吸煙、高血壓、糖尿病、氯吡格雷抵抗比例及CYP2C19 基因G681A位點(diǎn)AG型、AA型頻率顯著高于預(yù)后良好組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

2.6影響預(yù)后的多因素Logistic回歸分析 將預(yù)后不良作為因變量，上述單因素分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示糖尿病、氯吡格雷抵抗、攜帶CYP2C19 基因G681A位點(diǎn)AA型是不良預(yù)后發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表5。

表3 CYP2C19 基因多態(tài)性與氯吡格雷抵抗的相關(guān)性〔n(%)〕

表4 預(yù)后良好組與預(yù)后不良組一般資料比較

表5 不良預(yù)后的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

CYP2C19是CYP450家族中重要的藥物代謝酶，參與臨床2%左右的藥物代謝〔7〕。目前已有研究表明，CYP2C19 GG型與冠心病、冠脈綜合征等的發(fā)生有關(guān)〔8，9〕。Bykov等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C19 G636A 位點(diǎn)AG型基因使動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)增加3.8倍。Daniel〔11〕對(duì)急性冠脈綜合征患者的研究發(fā)現(xiàn)，攜帶CYP2C19 AA、AG型基因的患者發(fā)生腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)較未攜帶者明顯增加。本研究提示CYP2C19 G681A位點(diǎn)AA型基因、CYP2C19 G636A位點(diǎn)AA型和AG型基因與ISS的發(fā)病有關(guān)，推測(cè)CYP2C19 A等位基因可能與腦動(dòng)脈粥樣硬化形成有關(guān)，進(jìn)而引發(fā)ISS，但其具體機(jī)制有待研究。

CYP2C19在抗血小板聚集藥物的代謝中發(fā)揮重要作用。阿司匹林、氯吡格雷等作為前體藥物，需經(jīng)CYP2C19酶代謝為活性產(chǎn)物方能發(fā)揮抗血小板聚集作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，心腦血管疾病患者服用阿司匹林、氯吡格雷后出現(xiàn)藥物抵抗現(xiàn)象存在較大的個(gè)體差異，這可能與CYP2C19基因多態(tài)性有關(guān)〔12，13〕。劉志勤等〔14〕研究報(bào)道，攜帶CYP2C19 AA型、AG型、GG型基因的腦卒中患者在服用氯吡格雷后血小板聚集抑制率分別為(67.5±21.6)%、(57.6±23.4)%、(31.4±15.1)%，攜帶CYP2C19 AA型、AG型基因是氯吡格雷抵抗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Rosafio等〔15〕研究也得到相似結(jié)論，攜帶CYP2C19 G681A 和G636A位點(diǎn)A等位基因的患者口服氯吡格雷后起效時(shí)間較攜帶G等位基因的患者慢，達(dá)到峰值的時(shí)間為24～48 h，而攜帶G等位基因的峰值短于24 h。本研究證實(shí)攜帶CYP2C19 G681A位點(diǎn)AG型、AA型基因與氯吡格雷抵抗有關(guān)。但氯吡格雷抵抗與CYP2C19 G636A基因無(wú)明顯相關(guān)性，這與Cavallari等〔16〕報(bào)道相符。Cavallari等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中患者攜帶CYP2C19 G681A位點(diǎn)A等位基因與二磷酸腺苷誘導(dǎo)的血小板聚集呈正相關(guān)，而患者CYP2C19 G636A基因與二磷酸腺苷誘導(dǎo)的血小板聚集無(wú)明顯相關(guān)性。

目前關(guān)于CYP2C19基因多態(tài)性對(duì)ISS預(yù)后的影響研究主要集中在CYP2C19基因?qū)β冗粮窭椎挚沟挠绊懮?。馮芹等〔17〕研究報(bào)道，攜帶有CYP2C19慢代謝型功能缺失等位基因(AA、AG)的患者更易發(fā)生氯吡格雷抵抗，進(jìn)而導(dǎo)致抗血小板聚集治療失敗，是臨床治療不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。郭朝群等〔18〕研究報(bào)道，攜帶有CYP2C19慢代謝型功能缺失等位基因(AA、AG)是患者不良預(yù)后及終點(diǎn)事件發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果顯示氯吡格雷抵抗、攜帶CYP2C19 G681A位點(diǎn)AA型基因是不良預(yù)后發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與上述報(bào)道相符。此外，本研究顯示糖尿病也是ISS患者不良預(yù)后發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Ferlini等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者體內(nèi)發(fā)生的血管內(nèi)皮損傷、氧化應(yīng)激等可導(dǎo)致血小板活性增強(qiáng)，進(jìn)而影響氯吡格雷的藥效，增加臨床不良終點(diǎn)事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。由此提示，對(duì)于伴有糖尿病的ISS患者應(yīng)積極控制血糖或調(diào)整氯吡格雷治療方案，減少糖尿病對(duì)預(yù)后的影響。

綜上所述，CYP2C19 G681A位點(diǎn)AA型基因及 G636A位點(diǎn)AA型、AG型基因是ISS發(fā)病的易感基因，而CYP2C19 G681A位點(diǎn)AG型、AA型基因與氯吡格雷抵抗密切相關(guān)。此外，G681A位點(diǎn)AA型基因是ISS不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，臨床應(yīng)加強(qiáng)對(duì)ISS患者CYP2C19 基因多態(tài)性的檢測(cè)，對(duì)于攜帶A等位基因的患者，及早給予藥物干預(yù)或調(diào)整抗血小板藥物治療方案，改善患者預(yù)后。