HPLC法測(cè)定藏藥石榴蓮花散中鞣花酸和胡椒堿的含量

1.甘肅省定西市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅 定西 743000；2.甘肅省甘南藏族自治州藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅 甘南 747000；3.甘肅省甘南藏族自治州藏醫(yī)醫(yī)院，甘肅 甘南 747000；4.甘肅省甘南藏族自治州食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅 甘南 747000

民族醫(yī)藥學(xué)是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成部分，藏醫(yī)藥是我國(guó)醫(yī)藥寶庫(kù)中的瑰寶之一，在藏族人民的防病治病中發(fā)揮了不可磨滅的作用，以其獨(dú)特的療效越來(lái)越被大家關(guān)注。石榴蓮花散由石榴子、肉桂、豆蔻、蓽茇、波棱瓜子、黑冰片(炭)、訶子、薔薇花八味中藏藥材組成，具有溫中健胃，消食[1]的功效，用于“培根甲布”病，積食不化，“赤巴”病，“木布”病，胃腸傳染病等[2]。從藏成藥發(fā)展概況及現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究存在的局限性和相關(guān)問(wèn)題、方劑理論在藏成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中的指導(dǎo)意義進(jìn)行探討。當(dāng)前藏藥標(biāo)準(zhǔn)體系建設(shè)相對(duì)比較滯后，導(dǎo)致藏藥材生產(chǎn)、加工、管理過(guò)程不規(guī)范、不統(tǒng)一，優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定、有效、可控的藏藥材原料供給不足，嚴(yán)重制約了我省藏成藥產(chǎn)業(yè)實(shí)現(xiàn)整體轉(zhuǎn)型升級(jí)和提質(zhì)增效。藏成藥石榴蓮花散現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(藏藥第一冊(cè))》(1995年版)，但該標(biāo)準(zhǔn)中只有【性狀】和【檢查】項(xiàng)[3]，缺乏【鑒別】、【含量測(cè)定】項(xiàng)目，不能有效控制各組成成分的質(zhì)量，從而不能有效控制藏藥制劑的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)方法采用HPLC法對(duì)制劑中石榴子和訶子中鞣花酸進(jìn)行含量測(cè)定，采用HPLC法對(duì)制劑中蓽茇的胡椒堿進(jìn)行含量測(cè)定，從而更加有效的控制藏成藥石榴蓮花散的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀(配四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器)，Agilent1260高效液相色譜儀(配四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器)，Mettler toledo MS205-DU電子分析天平，MettlertoledoEL204-IG電子分析天平，Olympus BX43 CX31光學(xué)顯微鏡， GT SONIC-L30超聲波清洗器(廣州固特超聲有限公司)。

1.2 試藥鞣花酸對(duì)照品(批號(hào)：11959-201602，含量以89.3%計(jì))、胡椒堿對(duì)照品(批號(hào)：110775-201706，含量以98.9%計(jì))均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純(德國(guó)默克公司)；水為屈臣氏蒸餾水；其它所用試劑為分析純。石榴蓮花散樣品10批(來(lái)源：甘南藏族自治州藏醫(yī)藥研究院4批S1,S2，S3,S4,甘肅省夏河縣藏醫(yī)院3批S5，S6，S7，甘肅省碌曲縣西倉(cāng)寺院藏醫(yī)院3批S8，S9，S10)。

2 方法與結(jié)果

2.1 鞣花酸的含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鞣花酸對(duì)照品適量，加甲醇制成 253.2548 μg/mL的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，定容，即得對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取本品1.0 g，置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理40 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇，稀釋、定容至刻度，搖勻,取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按本品處方及制備工藝制得缺石榴子和訶子的陰性樣品，照“2.1.2”項(xiàng)供試品制備方法處理，即得缺石榴子和訶子的陰性對(duì)照溶液。

2.1.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性[4-6]色譜柱：Agilent 5 HC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸(15∶85)；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；進(jìn)樣量10 μL；體積流量：1.0 mL/min；柱溫30 ℃。

2.1.5 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀。結(jié)果表明，供試品色譜中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上有色譜峰，而陰性對(duì)照色譜中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上則未檢測(cè)到峰，對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

2.1.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述“2.1.1”對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1、2、3、5mL于50 mL量瓶中，2 mL于25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10 μL注入色譜儀，在“2.1.4”相色譜條件下測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得到回歸方程為Y=108.45X-118.17(r=0.999 9)，5.065～25.325μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL注入色譜儀，按“2.1.4”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定鞣花酸峰面積，計(jì)算其RSD=0.38%(n=6),表明該測(cè)定方法精密度良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(樣品S2)，按含量測(cè)定方法分別在0、2、4、6、8、12 h測(cè)定其鞣花酸含量。結(jié)果6次測(cè)定鞣花酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3130%，RSD=1.29%(n=6)。結(jié)果表明，樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn)取 同一批樣品(樣品S2)，按“2.1.2”方法制備供試品溶液，共6份，按含量測(cè)定方法測(cè)定其鞣花酸含量。結(jié)果6份供試品中鞣花酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.290%，RSD=1.28%(n=6)。結(jié)果表明，該測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知鞣花酸含量的同一批樣品0.4 g(樣品S2)，精密稱定，平行6份，分別精密加入鞣花酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液(253.2548 μg/mL)5 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL注入色譜儀，在2.1.4色譜條件下測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該含量測(cè)定方法的加樣回收率符合要求。

表1 石榴蓮花散中鞣花酸加樣回收率試驗(yàn)

2.1.11 樣品含量測(cè)定 取10批石榴蓮花散樣品，分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密吸取上述供試品溶液及鞣花酸對(duì)照品溶液各10 μL注入色譜儀，在“2.1.4”色譜條件下測(cè)定鞣花酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 10批石榴蓮花散樣品中鞣花酸、胡椒堿含量測(cè)定結(jié)果

2.2 胡椒堿的含量測(cè)定[7-8]

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取胡椒堿對(duì)照品適量置棕色容量瓶中，加甲醇制成 104.1417 μg/mL的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，定容，即得對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備[9]精密稱取本品1.0 g，置錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理40 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按本品處方及制備工藝制得缺蓽茇的陰性樣品，照“2.2.2”項(xiàng)供試品制備方法處理，即得缺蓽茇的陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱：Agilent 5 HC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(40：60)；檢測(cè)波長(zhǎng)：343 nm；進(jìn)樣量10 μL；體積流量：1.0 mL/min；柱溫30 ℃。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀。結(jié)果表明，供試品色譜中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上有色譜峰，而陰性對(duì)照色譜中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置上則未檢測(cè)到峰，對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取上述“2.2.1”對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1、2、3、5 mL于50 mL棕色容量瓶中，取2 mL于25 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取10 μL注入色譜儀，在“2.2.4”相色譜條件下測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得到回歸方程為Y=72.128X-0.5195(r=1.000 0)，10.414～52.071μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10 μL注入色譜儀，按“2.2.4”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定胡椒堿峰面積，計(jì)算其RSD=0.42%(n=6)，表明該測(cè)定方法精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液(樣品S3)，按含量測(cè)定方法分別在0,2,4,6,8,12 h測(cè)定其胡椒堿含量。結(jié)果6次測(cè)定胡椒堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.121%，RSD=0.22%(n=6)。結(jié)果表明，樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(樣品S3)，按“2.2.2”方法制備供試品溶液，共6份，按含量測(cè)定方法測(cè)定其胡椒堿含量。結(jié)果6份供試品中胡椒堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.119%，RSD=0.58%(n=6)。結(jié)果表明，該測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知胡椒堿含量的同一批樣品0.4 g(樣品S3)，精密稱定，平行6份，分別精密加入胡椒堿對(duì)照品儲(chǔ)備溶液(104.1417 μg/mL)5 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL注入色譜儀，在“2.2.4”色譜條件下測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該含量測(cè)定方法的加樣回收率符合要求。

表3 石榴蓮花散中胡椒堿加樣回收率試驗(yàn)

2.2.11 樣品含量測(cè)定 取10批石榴蓮花散樣品，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密吸取上述供試品溶液及胡椒堿對(duì)照品溶液各10 μL注入色譜儀，在“2.2.4”色譜條件下測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

方法選定過(guò)程中，石榴蓮花散方中8味藥，石榴子為主藥，通過(guò)查閱大量文獻(xiàn)資料顯示，石榴子中主要特征成分有石榴酸，鞣花酸等，但石榴酸是共軛三烯酸，其性質(zhì)不穩(wěn)定，存在同分異構(gòu)體，易氧化成醛、酮、酸、醇和環(huán)氧化物等易揮發(fā)的小分子物質(zhì)，且已有大量文獻(xiàn)研究采用HPLC法測(cè)定石榴籽中鞣花酸等鞣質(zhì)成分的含量[10]，色譜條件成熟，訶子中主要特征成分也有鞣花酸，故本實(shí)驗(yàn)選擇研究具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗病毒等藥理作用的鞣花酸為對(duì)照，進(jìn)行其含量測(cè)定，制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)用甘南州藏醫(yī)院提供的單味藥材模擬石榴蓮花散配方制成自配樣，用建立的實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定自配樣和石榴子、訶子單味中的鞣花酸含量，結(jié)果表明，自配樣中鞣花酸含量為石榴子和訶子單味中的總和。因此考慮建立高效液相色譜方法同時(shí)測(cè)定石榴子與訶子中鞣花酸的含量 。

過(guò)程中應(yīng)注意，蓽茇中主要活性化學(xué)成分是胡椒堿，其具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用。胡椒堿對(duì)光十分敏感，易發(fā)生光化學(xué)歧化作用產(chǎn)生異構(gòu)體。因此本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定蓽茇中胡椒堿的含量時(shí)，在取樣后加入溶媒超聲提取、過(guò)濾、稀釋等實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中要特別注意避光，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

實(shí)驗(yàn)中采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)被測(cè)成分鞣花酸、胡椒堿的純度進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果與對(duì)照品光譜圖一致，說(shuō)明被測(cè)峰基本為單一物質(zhì)。

本實(shí)驗(yàn)供試品溶液的制備方法中，供試品超聲提取時(shí)間的選擇試驗(yàn)了30 min、40 min、50 min，超聲時(shí)間30 min的待測(cè)成分含量較低，超聲時(shí)間40 min和50 min的待測(cè)成分含量較高，且相差不大，表明超聲40 min待測(cè)成分已基本提取完全，因此選擇超聲提取時(shí)間為40 min。

綜上，在現(xiàn)有試驗(yàn)條件下，本實(shí)驗(yàn)建立的高效液相色譜法測(cè)定鞣花酸和胡椒堿含量的方法，供試品制備前處理操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，專屬性高，結(jié)果可靠，可有效控制藏成藥石榴蓮花散的質(zhì)量。