HPLC法測(cè)定復(fù)方小檗堿鞣酸蛋白膠囊中鹽酸小檗堿的溶出度

1.貴州省食品藥品檢驗(yàn)所,貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，貴州 貴陽(yáng) 550004

復(fù)方小檗堿鞣酸蛋白膠囊(曾用名為瀉痢朗膠囊)是貴州泛德制藥有限公司獨(dú)家生產(chǎn)的止瀉藥，主要用于痢疾、急慢性腸炎等[1]?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為WS-10001-(HD-1111)-2002，該標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)樣品溶出度項(xiàng)目進(jìn)行控制[2]。溶出度作為仿制藥質(zhì)量和療效一致性評(píng)價(jià)的指標(biāo)之一，其結(jié)果優(yōu)劣對(duì)藥效產(chǎn)生至關(guān)重要的影響，同時(shí)也能間接的反映制劑原輔料及工藝的變化情況。作者目前未查詢到有關(guān)復(fù)方小檗堿鞣酸蛋白膠囊溶出度的文獻(xiàn)報(bào)道，但查詢到以鹽酸小檗堿為溶出度評(píng)價(jià)指標(biāo)的相關(guān)文獻(xiàn)，測(cè)定方法主要有高效液相色譜法和紫外分光光度法[3-5]。鹽酸小檗堿對(duì)多種革蘭陽(yáng)性菌及革蘭陰性菌均有抗菌作用，對(duì)幽門螺旋桿菌有抑制作用，臨床上主要用于治療腸道感染、如腸胃炎等[6-7]。本研究中運(yùn)用高效液相色譜法對(duì)復(fù)方小檗堿鞣酸蛋白膠囊進(jìn)行溶出度檢測(cè)，測(cè)定其所含鹽酸小檗堿量，從而有效建立溶出度檢查項(xiàng)目，為復(fù)方小檗堿鞣酸蛋白膠囊的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SOTAX溶出試驗(yàn)儀(瑞士SOTAX公司)；Thermo Ultimate3000高效液相色譜儀；島津LC-20A高效液相色譜儀； METTLER TOLEDO XS205電子天平；Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6×150 mm，5 μm)；Waters X Bridge C18色譜柱(4.6×150 mm，5 μm)；Thermo AcclaimTM C18色譜柱(4.6×150 mm，5 μm)。

1.2 試劑與試藥 鹽酸小檗堿對(duì)照品(110713-201814，中國(guó)食品藥品檢定研究院,質(zhì)量分?jǐn)?shù)86.7%)、醋酸鈉(AR，成都金山化學(xué)試劑有限公司，20170810)、冰醋酸(AR，天津市富宇精細(xì)化工有限公司，20151002)、甲醇(HPLC,美國(guó)TEDIA,17080670)；復(fù)方小檗堿鞣酸蛋白膠囊(批號(hào)：18092012、19012011、18092021、18052012、18072011、17112011、18052011、17122011、17072012、18092011)均由貴州泛德制藥有限公司提供。方法學(xué)實(shí)驗(yàn)樣品批號(hào)為18092012。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸鹽緩沖液[0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液和0.05 mol·L-1庚烷磺酸鈉溶液(1∶1)，含0.2%三乙胺，并用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0]-甲醇(43∶57)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為262 nm，進(jìn)樣量為10 μL。理論板數(shù)按小檗堿峰計(jì)算不低于3000，鹽酸小檗堿峰與相鄰峰之間的分離度應(yīng)符合要求。

2.2 溶出條件的優(yōu)選 查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版二部鹽酸小檗堿膠囊溶出度的測(cè)定方法[8]，采用溶出度與釋放度(通則0931第一法)，轉(zhuǎn)速為每分鐘120轉(zhuǎn)，選取水、0.1 mol·L-1鹽酸溶液、醋酸鹽緩沖液(pH4.0)(取114 mL1冰醋酸用水稀釋至1000 mL,取20.5 mL，再稱取醋酸鈉1.22 g，加水溶解并稀釋至1000 mL)、磷酸鹽緩沖液(pH6.6)(取磷酸二氫鈉1.74 g、磷酸氫二鈉2.7 g、氯化鈉1.7 g與0.2 g十二烷基硫酸鈉，加水使溶解成400 mL)為溶出介質(zhì)[3-6，9]。在5、10、15、20、30、45、60、90和120 min取樣，計(jì)算鹽酸小檗堿的累積釋放量，繪制溶出曲線。如圖1所示。

從溶出曲線可以看出，醋酸鹽緩沖液(pH-4.0)和水的累積釋放量高于另外兩種介質(zhì)，但兩種介質(zhì)的累積釋放量均不高，最高的只有51%(120 min)。故選取醋酸鹽緩沖液(pH4.0)和水為介質(zhì)，采用溶出度與釋放度(通則0931第二法)，轉(zhuǎn)速為每分鐘120轉(zhuǎn)進(jìn)行比較，在5、10、15、20、30、45、60、90和120 min取樣，計(jì)算鹽酸小檗堿的累積釋放量，繪制溶出曲線。如圖1所示。

從溶出曲線可以看出，醋酸鹽緩沖液(pH-4.0)是各時(shí)間點(diǎn)累積釋放量最大的溶出介質(zhì)，且滿足漏槽條件，故選擇醋酸鹽緩沖液(pH4.0)作為溶出介質(zhì)，但漿法120轉(zhuǎn)的累積溶出量120 min也只有76%，故采用溶出度與釋放度(通則0931第二法)，轉(zhuǎn)速為每分鐘150轉(zhuǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在5、10、15、20、30、45、60、90和120 min取樣，計(jì)算鹽酸小檗堿的累積釋放量，繪制溶出曲線，同時(shí)比較放置沉降籃與不放置沉降籃的累積釋放量。如圖1所示。從溶出曲線可以看出，采用漿法150轉(zhuǎn)，不放置沉降籃的是比較理想的溶出曲線。

最終選定的溶出條件為：取本品，照溶出度與釋放度測(cè)定法(通則0931第二法)，以醋酸鹽緩沖液(pH4.0)為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為每分鐘150轉(zhuǎn)，依法操作，經(jīng)45 min時(shí)，取溶液濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；另取鹽酸小檗堿對(duì)照品，精密稱定，加溶出介質(zhì)溶解并定量稀釋成每1 mL中約含0.12 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按“2.1”條下色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，計(jì)算每粒中鹽酸小檗堿的溶出量。限度為標(biāo)示量的70%，應(yīng)符合規(guī)定。

2.3 專屬性試驗(yàn) 采用廠家提供的輔料，按處方進(jìn)行稱量配制陰性樣品，按“2.1”條下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，陰性樣品未見吸收峰；測(cè)定樣品中鹽酸小檗堿峰與對(duì)照溶液中的保留時(shí)間一致，鹽酸小檗堿峰峰型良好，與相鄰峰分離度達(dá)到要求。如圖2所示。

2.4 線性 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備：精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品0.027 97 g置20 mL量瓶中，加溶出介質(zhì)溶解并稀釋至刻度，即得。

精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0和5.0 mL置20 mL量瓶中，加溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，即得線性溶液1到7。分別吸取線性溶液1到7各10 μL注入液相色譜儀中，按“2.1”條下色譜條件測(cè)定峰面積，記錄色譜圖。以鹽酸小檗堿峰面積(A)為橫坐標(biāo)，鹽酸小檗堿對(duì)照品的濃度C(μg·L-1)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得鹽酸小檗堿回歸方程：C=1.980A+0.603(r=1)，如圖3所示。表明鹽酸小檗堿在30.312 5～303.124 9 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按優(yōu)選出的方法制備供試品溶液和對(duì)照品溶液，室溫下分別在0、1、2、4、6、8和12 h各精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL注入液相色譜儀中，按“2.1”條下色譜條件測(cè)定峰面積，記錄色譜圖,結(jié)果對(duì)照品溶液RSD為0.11%，供試品溶液RSD為0.13%。表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 回收率試驗(yàn) 對(duì)照品貯備液的制備：精密稱取鹽酸小檗堿原料(含量為84.32%)0.146 2 g置100 mL量瓶中，加溶出介質(zhì)溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

樣品溶液的制備：按處方精密稱取除鹽酸小檗堿外的相當(dāng)于處方量80%、100%和120%的各原輔料置100 mL量瓶中，高、中、低3種濃度各精密加入上述對(duì)照品貯備液12 mL、10 mL和8 mL。加溶出介質(zhì)溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。高、中、低3個(gè)濃度樣品，各平行制備3份，共9份。結(jié)果鹽酸小檗堿回收率為99.36%(n=9，RSD=0.98%)。

2.7 耐用性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL注入液相色譜儀中，按“2.1”條下色譜條件測(cè)定峰面積，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算溶出量。比較了不同色譜柱、不同柱溫、不同流速、不同流動(dòng)相比列和不同儀器對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，各條件下，各色譜峰峰型良好，與相鄰峰分離度均達(dá)到要求，說(shuō)明該方法耐用性試驗(yàn)結(jié)果良好。

2.8 檢出限和定量限的測(cè)定 精密稱取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，并稀釋制成不同濃度的對(duì)照品溶液，精密吸取各不同濃度的對(duì)照品溶液注入液相色譜儀中，按含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定峰面積，記錄色譜圖，以信噪比S/N≈10時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限、S/N≈3時(shí)的質(zhì)量濃度為檢測(cè)限。測(cè)得鹽酸小檗堿的檢出限和定量限分別為2.425 ng和7.275 ng。

2.9 樣品溶出度測(cè)定 按優(yōu)選出的溶出度方法測(cè)定10批次樣品的溶出度。結(jié)果見表1。

表1 10批次樣品溶出度測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 測(cè)定結(jié)果 從10批樣品的測(cè)定結(jié)果可以看出，各批次樣品溶出度均大于限度70%，各批次6粒測(cè)定結(jié)果RSD不大，10批次樣品間RSD為5.98%，各批次間溶出行為基本一致，反應(yīng)了廠家各批次間原輔料及工藝等情況控制較好，批間差異小。

3.2 濾膜吸附 實(shí)驗(yàn)過程中考慮到濾膜吸附對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，比較了兩種纖維素濾頭(直徑13 mm,0.45 μm和直徑25 mm,0.45 μm)對(duì)鹽酸小檗堿的吸附影響，分別比較了去掉初濾液0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10 mL樣品的測(cè)定結(jié)果，RSD分別為0.50%和0.45%，表明兩種纖維素濾頭對(duì)鹽酸小檗堿均沒有吸附。

3.3 沉降籃對(duì)溶出度的影響 本品溶出度測(cè)定結(jié)果與是否放置沉降籃有很大的關(guān)系，從圖1可以看出，放置了沉降籃的樣品溶出度測(cè)定值與未放置沉降籃的測(cè)定值在取樣時(shí)間點(diǎn)鹽酸小檗堿的溶出量相差約30個(gè)百分點(diǎn)，在測(cè)定過程中觀察到，放置沉降藍(lán)的樣品在取樣時(shí)樣品黏附成團(tuán)，一直滯留在沉降籃中，故其溶出受水流以及與攪拌槳相對(duì)位置的影響較大[10]；未放置沉降籃的樣品剛投入溶出杯中時(shí)，漂浮在溶出介質(zhì)中，但所有樣品均在投入溶出杯中2～3 min時(shí)，囊殼崩解，內(nèi)容物逐漸分散在溶出介質(zhì)中，在取樣時(shí)間點(diǎn)時(shí)，沒有樣品黏附成團(tuán)現(xiàn)象，故其溶出受水流以及與攪拌槳相對(duì)位置的影響較小[10]，因此，本品在測(cè)定溶出度時(shí)不放置沉降籃較為科學(xué)合理。

3.4 結(jié)論 本文使用HPLC法對(duì)復(fù)方小檗堿鞣酸蛋白膠囊中鹽酸小檗堿的溶出度進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、可靠。本研究是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)提升課題內(nèi)容，該課題還對(duì)處方中的鹽酸小檗堿和其他3種成分進(jìn)行了含量控制，因此溶出度的色譜條件選擇含量測(cè)定的色譜條件，方便企業(yè)及相關(guān)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)后續(xù)的質(zhì)量監(jiān)控工作，本次研究為復(fù)方小檗堿鞣酸蛋白膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及產(chǎn)品質(zhì)量的提升奠定了基礎(chǔ)。