溫度對(duì)松材線蟲(chóng)內(nèi)寄生菌Esteya vermicola生長(zhǎng)和感染能力的影響

朱映，沈婧，賀英豪，梁永嬋，路藝，溫秀軍

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642)

由松材線蟲(chóng)Bursaphelenchusxylophilus引起的松材線蟲(chóng)病對(duì)松樹(shù)具有毀滅性的危害，在我國(guó)主要危害的樹(shù)種包括馬尾松Pinusmassoniana、赤松Pinusdensiflora、黑松Pinusthunbergii等[1-2]。通過(guò)調(diào)控病原松材線蟲(chóng)、傳播媒介松墨天牛和寄主松樹(shù)以及三者間的關(guān)系，以預(yù)防為主，結(jié)合物理、化學(xué)，和生物防治進(jìn)行綜合治理，但均未能真正防止松材線蟲(chóng)病的傳播[3-5]。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)松材線蟲(chóng)的生物防治主要是利用植物性殺線蟲(chóng)活性物質(zhì)和生防微生物來(lái)實(shí)現(xiàn)[6-8]。Esteyavermicola是第一個(gè)被報(bào)道的松材線蟲(chóng)內(nèi)寄生真菌，屬于子囊菌門(mén)Ascomycota子囊菌綱Ascomycetes肉座菌目Hypocreales的Ophiostomataceae科埃斯特氏屬Esteya的唯一種。E.vermicola是松材線蟲(chóng)內(nèi)寄生真菌，在體外試驗(yàn)中表現(xiàn)出高侵染率，是一種生物防控松材線蟲(chóng)病的潛在應(yīng)用對(duì)象。迄今在全球范圍內(nèi)已報(bào)道的E.vermicola有6個(gè)菌株。本試驗(yàn)中所用菌株CBS115803，是2000年在捷克斯洛伐克櫟屬植物害蟲(chóng)正毛束小蠹Scolytusintricatus表面真菌群中發(fā)現(xiàn)的，該菌株與E.vermicola其他菌株相比，對(duì)松材線蟲(chóng)的侵染效果更佳，有著較高的粘附率和致死率，并且不會(huì)影響寄主松樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育[9-13]。為探索E.vermicola真菌的最適生長(zhǎng)溫度以及不同溫度對(duì)真菌E.vermicola感染松材線蟲(chóng)的影響，筆者針對(duì)內(nèi)寄生真菌E.vermicola對(duì)松材線蟲(chóng)的粘附侵染作用進(jìn)行試驗(yàn)，以期尋找控制松材線蟲(chóng)更加直接的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 真菌菌株E.vermicolaCBS115803和灰葡萄孢菌Botrytiscinerea，由韓國(guó)忠南大學(xué)成昌根教授惠贈(zèng)，在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)森林保護(hù)學(xué)實(shí)驗(yàn)室4 ℃條件下斜面保存。供試松材線蟲(chóng)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院王新榮老師實(shí)驗(yàn)室提供，在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)森林保護(hù)學(xué)實(shí)驗(yàn)室中利用灰葡萄孢菌繁殖以供利用。

PDA培養(yǎng)基，PDB培養(yǎng)基，WA培養(yǎng)基參照Liou 等人的配置方法[ 9，14]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1E.vermicola孢子懸浮液的制備 在無(wú)菌條件下，取E.vermicola菌落生長(zhǎng)旺盛的平板邊緣，用打孔器取直徑5 mm菌塊，接種到PDA平板中間，用封口膜封好，于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。其次將PDA培養(yǎng)活化過(guò)的真菌轉(zhuǎn)接到PDB培養(yǎng)基中，于26 ℃恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)。6 d后用抽濾裝置過(guò)濾得到純的孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板確定孢子濃度，4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 松材線蟲(chóng)懸浮液的制備 將灰葡萄孢菌接種至PDA平板上，26 ℃恒溫箱中培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿平板，接入松材線蟲(chóng)后繼續(xù)培養(yǎng)至灰葡萄孢菌絲消失。使用時(shí)將培養(yǎng)基挑出，用濾紙包住，放入貝爾曼漏斗中，將無(wú)菌水倒至淹沒(méi)培養(yǎng)基，靜置，配置成一定濃度的線蟲(chóng)懸浮液。

1.2.3 溫度對(duì)E.vermicola生長(zhǎng)的影響 無(wú)菌條件下，使用打孔器從菌落生長(zhǎng)旺盛的平板邊緣取5 mm大小相同的圓形菌塊，放置于PDA培養(yǎng)基中心，并用封口膜封好。設(shè)置15，20，25，30，35 ℃5個(gè)處理溫度，每處理3個(gè)重復(fù)，在培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)第0，1，3，5，7，9，11天測(cè)量E.vermicola生長(zhǎng)量，以菌落直徑大小作為衡量生長(zhǎng)量的指標(biāo)。

1.2.4 溫度對(duì)E.vermicola真菌孢子萌發(fā)的影響 無(wú)菌條件下，取1 mL初始分生孢子濃度為1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液均勻涂布于WA平板上，并用封口膜封好。設(shè)置15，25，35 ℃3個(gè)處理溫度，每處理3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)12，24，48，72，96 h后，分別檢測(cè)不同溫度下E.vermicola孢子的萌發(fā)率和1～8 d 后產(chǎn)生的彎孢數(shù)量。

1.2.5 不同溫度下E.vermicola真菌感染松材線蟲(chóng)能力測(cè)定 無(wú)菌條件下，取1 mL初始分生孢子濃度為1×106個(gè)/mL的E.vermicola真菌孢子懸浮液均勻涂布于WA平板。置于26 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 d后接入1 000頭松材線蟲(chóng)，然后分別放置于15，25，35 ℃感染。分別于感染后的6，12，24 h計(jì)算松材線蟲(chóng)的粘附率和死亡率。

粘附率(%)=粘附松材線蟲(chóng)數(shù)/松材線蟲(chóng)總數(shù)×100

死亡率(%)=粘附松材線蟲(chóng)死亡數(shù)/松材線蟲(chóng)總數(shù)×100

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，最小顯著差數(shù)法(LSD，P=0.05)進(jìn)行處理間顯著性檢驗(yàn)，并用Microsoft Excel 2007軟件作圖。圖中數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)E.vermicola真菌生長(zhǎng)的影響 不同溫度對(duì)E.vermicola真菌菌落生長(zhǎng)有顯著影響(P<0.05)。25 ℃下真菌生長(zhǎng)最快，20 ℃下真菌生長(zhǎng)次之，35 ℃下真菌生長(zhǎng)最慢。不同溫度處理下的E.vermicola真菌生長(zhǎng)速率開(kāi)始差別不大，從第5天開(kāi)始，20 ℃和25 ℃開(kāi)始迅速增長(zhǎng)(表1)。

表1 5種溫度下培養(yǎng)不同時(shí)間后Esteya vermicola菌株CBS115803平板菌落直徑 mm

注：最小顯著差數(shù)法檢驗(yàn)(LSD)。同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫(xiě)字母者表示組間差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫(xiě)字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)。

不同溫度對(duì)E.vermicola真菌菌株CBS115803的月型孢子萌發(fā)具有顯著影響(P<0.05)。25 ℃下，真菌孢子萌發(fā)率最快，培養(yǎng)48 h后，月型孢子萌發(fā)率達(dá)到100%；其次為15 ℃，培養(yǎng)96 h后，孢子萌發(fā)率達(dá)到100%(表2)。35 ℃處理組的孢子，第8天萌發(fā)率才達(dá)到100%。

表2 3種溫度下平板培養(yǎng)不同時(shí)間后Esteya vermicola菌株CBS115803孢子萌發(fā)率 %

注：最小顯著差數(shù)法檢驗(yàn)(LSD)。同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫(xiě)字母者表示組間差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫(xiě)字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)。

2.2 溫度對(duì)E.vermicola感染松材線蟲(chóng)能力的影響 培養(yǎng)48 h內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，粘附率不斷上升。15 ℃處理中孢子對(duì)松材線蟲(chóng)的粘附率最高，達(dá)到60.67%，侵染活力顯著高于其他2個(gè)處理(P<0.05)，25 ℃和35 ℃處理中線蟲(chóng)也能被孢子粘附，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，被孢子粘附的線蟲(chóng)并未出現(xiàn)明顯增加，6 h后粘附率保持相對(duì)穩(wěn)定(表3)。

35 ℃下菌株對(duì)松材線蟲(chóng)的致死率顯著低于其他溫度，另外兩個(gè)溫度中菌株在致死率上差異不顯著(P>0.05)。在培養(yǎng)12 h內(nèi)，3種溫度下有被菌株孢子粘附的松材線蟲(chóng)均開(kāi)始死亡，但死亡率均低于10%，且變化不明顯。在培養(yǎng)48 h后，松材線蟲(chóng)死亡率15 ℃下最高，為41.67%，其次為25 ℃，為36.54%。在35 ℃下菌株對(duì)松材線蟲(chóng)的侵染活力顯著低于其他溫度，只有5.67%(表3)。

表3 3種溫度下培養(yǎng)不同時(shí)間后Esteya vermicola孢子對(duì)松材線蟲(chóng)的粘附率和致死率 %

注：最小顯著差數(shù)法檢驗(yàn)(LSD)。同列數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫(xiě)字母者表示組間差異顯著(P<0.05)，標(biāo)有相同小寫(xiě)字母者表示組間差異不顯著(P>0.05)。

3 結(jié)論與討論

采用不同溫度條件培養(yǎng)菌株，分析菌落直徑、萌發(fā)率等，發(fā)現(xiàn)在不同溫度下真菌生長(zhǎng)狀況有不同程度的差異。Wang等研究表明將E.vermicola置于26 ℃條件下培養(yǎng)，所有E.vermicola均萌發(fā)并且產(chǎn)生月型孢子[15]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在15 ℃和25 ℃培養(yǎng)條件下，E.vermicola均能萌發(fā)并產(chǎn)生具有粘附線蟲(chóng)功能的月型孢子，與前人研究結(jié)果相符；而在35 ℃培養(yǎng)條件下，雖然孢子最終能在第8天達(dá)到100%萌發(fā)，但并未產(chǎn)生月型孢子，最后導(dǎo)致其喪失了感染松材線蟲(chóng)的能力。從試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，春秋兩季更適合孢子的生長(zhǎng)，若溫度過(guò)低會(huì)抑制真菌生長(zhǎng)，而長(zhǎng)時(shí)間的高溫則會(huì)使孢子失去活性停止生長(zhǎng)。所以在中國(guó)松材線蟲(chóng)病危害嚴(yán)重地區(qū)，進(jìn)行有效的生物防治時(shí)應(yīng)該考慮不同季節(jié)對(duì)真菌孢子的影響。

本實(shí)驗(yàn)表明在不同溫度下，E.vermicola孢子對(duì)松材線蟲(chóng)均具有侵染活力，首次發(fā)現(xiàn)溫度與真菌侵染活力呈負(fù)相關(guān)，即孢子對(duì)松材線蟲(chóng)的侵染力隨著侵染溫度的降低而增加，在低溫條件下侵染能力明顯強(qiáng)于高溫。在以往的研究中，室溫條件下孢子粘著松材線蟲(chóng)48 h后，菌絲擠破線蟲(chóng)體壁向外長(zhǎng)出，3～4 d 后菌絲開(kāi)始生長(zhǎng)、分枝蔓延，6 d后長(zhǎng)出的菌絲開(kāi)始產(chǎn)孢進(jìn)行二次生長(zhǎng)，在室溫下8～10 dE.vermicola完全消解線蟲(chóng)[9,16-18]。本實(shí)驗(yàn)中15 ℃條件下孢子侵染線蟲(chóng)12 h后，已有菌絲擠破線蟲(chóng)體壁向外長(zhǎng)出，部分線蟲(chóng)已被侵染致死。一方面，溫度條件的差異可能直接影響真菌產(chǎn)生的分生孢子的種類不一，導(dǎo)致侵染活力的表現(xiàn)不同；另一方面，溫度也可能間接影響松材線蟲(chóng)的活性，進(jìn)而引起侵染活性的差異。

真菌E.vermicola孢子中的月型孢子具有生物防治作用。因此，從理論上來(lái)說(shuō)，獲取大量具有高致病性的月型孢子是利用該真菌防治松材線蟲(chóng)的基本前提，可將侵染活力最高時(shí)的溫度考慮在內(nèi)，進(jìn)行綜合性分析。而在真菌侵染過(guò)程中，15 ℃下對(duì)松材線蟲(chóng)的致病力相對(duì)更高，可能是低溫對(duì)線蟲(chóng)的行為能力造成了一定影響，導(dǎo)致線蟲(chóng)更容易被孢子粘附，具體原因有待進(jìn)一步研究。