乙醇對斑馬魚胚胎發(fā)育的急性毒害效應(yīng)

李愛君，張玉茹，夏雪梅，王彬容，王維香

(西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039)

乙醇(Ethanol)是一種有機化合物，俗稱酒精。酒精可以給人體帶來快感，所以酒精類飲品深受人們喜愛；但是過度飲酒會引起酒精中毒，酒精依賴，還可引發(fā)酒精相關(guān)的意外傷害、胰腺炎和胎兒酒精綜合征等疾病[1-2]。有證據(jù)表明，在大量飲酒者中，癌癥的發(fā)病率增高是由酒精的毒性所引起的。酒精可促進(jìn)癌細(xì)胞生長。酒精可以成為溶劑，幫助致癌物滲入細(xì)胞膜。酒精還可通過損害肝細(xì)胞而降低肝臟的解毒力，使肝臟無法消除或滅活致癌物。大量飲酒受試者(每天大于3次)相比于不飲酒的人更易罹患5種癌癥：上消化道/呼吸道癌癥、肺癌、女性乳腺癌、結(jié)直腸腫瘤及黑色素瘤，而輕中度飲酒受試者更易患除肺癌外的其余4種腫瘤[3]。乙醇也是常見的致畸源，妊娠期間攝入乙醇對胚胎發(fā)育有嚴(yán)重影響，胎兒酒精綜合征是最主要的發(fā)育畸形，表現(xiàn)為頭面部畸形、發(fā)育遲緩、心血管發(fā)育障礙和中樞神經(jīng)系統(tǒng)畸形等，這部分患兒給家庭和社會帶來了很大的負(fù)擔(dān)[4-5]。

斑馬魚(Daniorerio)是原產(chǎn)于印度河流的熱帶淡水魚，目前已成為世界排名第三的受科研工作者重視的模式生物，被廣泛應(yīng)用于發(fā)育、藥物篩選、毒理等方面研究。斑馬魚作為模式生物的優(yōu)勢很突出，具有胚胎體外授精發(fā)育，胚體透明，產(chǎn)卵量大，操作簡單，可重復(fù)性，成本低，便于管理等優(yōu)點，并且和人類基因有著87%的高度同源性，這意味著其實驗結(jié)果大多數(shù)情況下適用于人體[6]。

為深入了解乙醇對胚胎發(fā)育的影響，本文研究了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇對斑馬魚胚胎的致死率、孵化率、致畸率以及心包大小、心跳強弱等的影響作用，對乙醇的毒害作用進(jìn)行初步評估，為乙醇對人體胚胎毒害的相關(guān)研究提供參考基礎(chǔ)，同時也為以斑馬魚為模型研究乙醇毒害提供依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

體形正常，魚鱗和魚鰭無破損，游動靈活，捕食敏捷的野生型斑馬魚雌雄成魚。

1.1.2 實驗試劑

95%乙醇，分析純。

1.1.3 實驗儀器

中科海斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(青島中科海海水處理有限公司)，BCD-176DA型海爾冷藏冰箱(青島海爾股份有限公司)，恒溫培養(yǎng)箱(CB1350，上海皓莊儀器有限公司)，SZX10型OLYMPUS顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)Scope視屏成像系統(tǒng)，JA2003型電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)，BSA224S-CW型千分之一電子稱量天平(賽多利科學(xué)儀器(北京)有限公司)，六孔板。

1.2 方法

胚胎培養(yǎng)液的配制：分別稱量NaCl 3.5 g、KCl 0.05 g、NaHCO30.025 g、CaCl20.1 g，用少量純凈水溶解，再用純凈水定容至1 L。

1.2.1 處理液的配制

用95%乙醇配制10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.5%、1%、1.3%、1.5%、2%的乙醇，對照組采取胚胎培養(yǎng)液來培養(yǎng)。

1.2.2 實驗步驟

1.2.2.1 斑馬魚飼養(yǎng)

用中科海斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)養(yǎng)殖，保證每日14 h的光照，養(yǎng)殖水為至少曝氣3 d，紫外線照射殺菌，并增氧的循環(huán)水，水溫控制在(28±1)℃。成年斑馬魚每日喂食2次適合熱帶魚的營養(yǎng)飼料小薄片及豐年蝦，喂養(yǎng)后及時清理缸中的糞便。

1.2.2.2 收集胚胎

實驗前一天20:00按2:1的比例選取健康的性成熟活潑斑馬魚的雄魚和雌魚放入盛有養(yǎng)殖水的交配盒中，用隔板隔開，進(jìn)行遮光處理。實驗當(dāng)天8:00將隔板拿開，雌雄魚追逐開始產(chǎn)卵，并記錄產(chǎn)卵時間。30 min后將魚卵挑出并清洗干凈，使其無異物附著，顯微鏡下檢查是否有不合格的胚胎，即觀察胚胎是否分裂均勻或死亡。

1.2.2.3 乙醇處理

將2 hpf胚胎在顯微鏡下觀察，選擇表面光滑、分裂均勻的胚胎放入6孔板中，每孔20只胚胎，處理液5 mL，觀察胚胎暴露至96 hpf的發(fā)育情況，重復(fù)3次。每隔24 h更換新鮮處理液，同時挑出死胎。

1.2.2.4 觀察記錄

分別在24、48、72、96 hpf觀察記錄胚胎死亡情況，在48、72、96 hpf記錄胚胎孵化情況以及在72 hpf記錄胚胎的畸形率；在各處理組中隨機挑取5個個體來進(jìn)行測量記錄各暴露階段斑馬魚測量指標(biāo)：48、72 hpf胚胎20 s的心跳次數(shù)，72、96 hpf胚胎的體長，72 hpf胚胎的心包面積以及96 hpf胚胎眼睛背面長度。

1.2.2.5 斑馬魚胚胎細(xì)胞死亡熒光染色

將72 hpf的孵化仔魚用5 mg/L吖啶橙溶液在28.5 ℃恒溫避光染色30 min，染色結(jié)束后用胚胎培養(yǎng)液漂洗3次，每次漂洗5 min，直到染色劑漂洗干凈，用0.05%麻醉劑麻醉1～3 min，用熒光顯微鏡觀察斑馬魚暴露后的細(xì)胞凋亡情況，并用ImageJ測定熒光強度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用改良寇式法[7]計算72 h時的EC50(受試動物半數(shù)產(chǎn)生效應(yīng)變化的濃度)、96 h時的LC50(受試動物半數(shù)死亡的濃度)以及IC50(受試動物半數(shù)被抑制孵化的濃度)。用Excel單因素方差分析進(jìn)行處理組與對照組間的顯著性差異分析，*P<0.05，**P<0.01。用ImageJ軟件處理熒光圖片后可直接得出Area和Intden，平均密度=Intden/Area，以CK為相對值100，換算出不同濃度的處理圖片的相對熒光強度。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇對斑馬魚胚胎發(fā)育的孵化、致死和致畸毒性效應(yīng)

2.1.1 乙醇對斑馬魚胚胎孵化率的影響

由圖1和圖2(A)可知，對照組在48 hpf時斑馬魚胚胎開始孵化，72 hpf內(nèi)全部孵化，而處理組在48 hpf并未開始孵化，從96 hpf不同處理組的孵化率可以看出隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，孵化率下降，胚胎的顏色加深，并呈劑量效應(yīng)，表明乙醇對斑馬魚胚胎孵化有抑制作用。96 hpf時對照、0.5%、1%、1.3%、1.5%和2%乙醇處理的胚胎孵化率分別為100%、100%、100%、100%、90%和15%；計算乙醇對胚胎96 h-IC50為1.56%(1.35%～1.80%，95%限制范圍)。

2.1.2 乙醇對斑馬魚胚胎的致死效應(yīng)

與對照組相比，隨中毒時間延長，乙醇處理組斑馬魚胚胎隨處理濃度增加死亡率上升，呈劑量效應(yīng)(圖2(B))。96 hpf時對照組、0.5%、1%、1.3%、1.5%和2%乙醇處理的胚胎死亡率分別為15%、15%、20%、25%、30%和65%；計算乙醇對斑馬魚胚胎的96 h-LC50為1.22%(0.91%～1.63%，95%限制范圍)。

2.1.3 乙醇對斑馬魚胚胎的致畸率影響

圖1(E)顯示乙醇處理后的斑馬魚胚胎出現(xiàn)心包水腫、尾部打結(jié)、卵黃淤血、脊柱彎曲及不孵化，在顯微鏡中還觀察到因水腫，斑馬魚胚胎無法保持平衡，且各種表型上的畸形情況隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而愈加顯著。從圖2(C)得知乙醇對斑馬魚胚胎發(fā)育的致畸率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而上升。72 hpf時對照組、0.5%、1%、1.3%、1.5%和2%乙醇處理的斑馬魚胚胎致畸率分別為5%、35%、70%、75%、80%和100%；計算乙醇對斑馬魚胚胎的72 h-EC50為1.01%(0.77%～1.32%，95%限制范圍)。

圖1 乙醇對斑馬魚胚胎形態(tài)發(fā)育的影響(A：24hpf；B：48hpf；C：72hpf；D：96hpf；E：96hpf致畸部位)

2.2 乙醇對斑馬魚胚胎體長發(fā)育、眼睛發(fā)育和心臟發(fā)育的影響

2.2.1 乙醇對斑馬魚胚胎體長發(fā)育的影響

72和96 hpf測量斑馬魚孵化仔魚體長時，2%處理組胚胎未孵化或尾部彎曲嚴(yán)重導(dǎo)致無法測量。圖3(A)表明，斑馬魚仔魚體長隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而變短，且在實驗中發(fā)現(xiàn)有很多胚胎因乙醇作用而未完全孵化或造成尾部彎曲打結(jié)，該致畸作用隨處理液濃度的增大而更加顯著。乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到1.3%時，乙醇對斑馬魚體長抑制作用顯著。

2.2.2 乙醇對斑馬魚胚胎眼睛發(fā)育的影響

測量96 hpf斑馬魚眼睛直徑時，因2%處理組胚胎呈未孵化狀態(tài)，無法測量；從圖3(B)可以看出，與對照組相比，處理組斑馬魚眼睛直徑更短，并且該致畸作用呈劑量效應(yīng)。乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到1.3%時，乙醇對斑馬魚眼睛直徑抑制作用明顯。

圖2 乙醇對斑馬魚胚胎孵化率(A)、死亡率(B)及72hpf畸形率(C)的影響

2.2.3 乙醇對斑馬魚胚胎心臟發(fā)育的影響

48 hpf時即觀察到體積分?jǐn)?shù)超過1.3%的乙醇斑馬魚處理組心跳緩慢且微弱無力。測量48和72 hpf斑馬魚胚胎心跳次數(shù)，結(jié)果見圖3(C)。由圖3(C)可知，斑馬魚胚胎20 s心跳次數(shù)隨乙醇體積分?jǐn)?shù)升高而減少，并呈劑量關(guān)系。48 hpf乙醇體積分?jǐn)?shù)1.3%時，斑馬魚心跳與對照組相比，心跳緩慢現(xiàn)象明顯；而72 hpf時乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到1%，斑馬魚心跳與對照相比已緩慢顯著。斑馬魚心跳次數(shù)與乙醇體積分?jǐn)?shù)和處理時間均成劑量關(guān)系。測量72 hpf時斑馬魚胚胎心包面積(圖3(D))發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，經(jīng)乙醇處理的斑馬魚胚胎心包面積明顯增大，且呈劑量關(guān)系。在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.5%時，斑馬魚心包面積與對照組已有顯著差異。乙醇對胚胎心血管系統(tǒng)的致畸作用在許多脊椎動物中都有發(fā)現(xiàn)[8]。錢林溪等[9]研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚胚胎循環(huán)系統(tǒng)對乙醇暴露非常敏感，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，不完整的循環(huán)系統(tǒng)等畸形率也逐漸升高，與本研究結(jié)果類似。

注：*表示顯著；**表示極顯著

圖3 乙醇對斑馬魚胚胎體長(A)、96 hpf眼睛直徑(B)、心跳(C)及72 hpf心包面積(D)發(fā)育的影響

2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)越高對斑馬魚的毒害作用越強

72 hpf時對胚胎進(jìn)行熒光染色，從圖4可直接看出隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，所染色的胚胎熒光強度增強，并且在卵黃處最強。用ImageJ軟件處理數(shù)據(jù)(見圖5)，也可直接看出相對熒光強度隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而呈劑量效應(yīng)。表明乙醇體積分?jǐn)?shù)越高對斑馬魚的毒害作用越強。

3 結(jié)論

本研究顯示，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加和處理時間延長，斑馬魚胚胎的致畸率和致死率提高、孵化率降低、體長變短、以及心跳減慢。乙醇導(dǎo)致的斑馬魚胚胎發(fā)育致畸效應(yīng)主要表現(xiàn)為尾部打結(jié)、眼睛變小、心包水腫、脊柱彎曲，與胎兒酒精綜合征相似。細(xì)胞凋亡研究表明，乙醇處理導(dǎo)致斑馬魚胚胎細(xì)胞死亡。

圖4 72 hpf斑馬魚胚胎熒光染色圖

圖5 乙醇對72 hpf斑馬魚胚胎細(xì)胞死亡的影響