傷科黃藥微生物限度檢查法的適用性考察分析

張荔

祖國醫(yī)學(xué)是我國醫(yī)療體系不可或缺的重要組成部分，中醫(yī)中藥在疾病的預(yù)防與控制中發(fā)揮了重要作用。許多醫(yī)院自制藥均為中藥制劑，臨床應(yīng)用非常廣泛。本研究中的傷科黃藥為我院自制，具有顯著的殺蟲利濕、清熱解毒的功效[1]。根據(jù)國家規(guī)定，醫(yī)院自制藥劑均應(yīng)符合規(guī)定的制劑標準，2015 年版中國藥典規(guī)定，應(yīng)對傷科黃藥的微生物檢查方法進行適用性考察，鑒于以上認識，筆者進行了本研究以尋找正確的微生物檢查法[2]。本研究就采用了3 種方法對傷科黃藥進行控制菌和微生物計數(shù)驗證，結(jié)果顯示3 種方法均符合新版藥典要求，且穩(wěn)定可行，可用于傷科黃藥的微生物限度檢查。

1 資料與方法

1.1 儀器

本研究是選取2017 年1 月—2018 年12 月期間，在湖北省襄陽市中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部進行研究的傷科黃藥。KSF220 集菌培養(yǎng)器、HTY-2000B 集菌儀、LAS-9203A 熱空氣消毒箱、LBI-250 生化培養(yǎng)箱、PL602-L 電子天平、HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋、DW-86L288型-80℃立式超低溫保存箱、SW-CJ-2FD 潔凈工作臺、LMQC 立式滅菌器、QYYS-20A 超純水機。

1.2 試藥

傷科黃藥：醫(yī)院自制，500 mL×400 瓶，藥方為黃連須等。氧化酶試劑、兔血漿、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液[3]。

1.3 菌種

黑曲霉、白色念珠菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌。

1.4 試驗菌制備

室溫放置黑曲霉菌懸液，制備沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基，用無菌吸管吸取2 滴菌懸液滴在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上，25℃培養(yǎng)5 d，然后用3～5 mL 蛋白胨緩沖液洗脫孢子，將孢子菌懸液接種到沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面復(fù)壯，25℃培養(yǎng)5 d，再使用3 mL～5 mL 蛋白胨緩沖液洗脫孢子。將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌分別轉(zhuǎn)到8～10 mL 35℃胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇1 d。將白色念珠菌轉(zhuǎn)移到8～10 mL 25℃沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中復(fù)蘇2 d，然后轉(zhuǎn)移到10 mL 25℃沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基復(fù)壯1 d。用0.9%氯化鈉溶液稀釋上述各菌懸液，用平皿法行活菌點計，選擇含菌量50～100 cfu/mL 的稀釋菌液當作試驗菌[4]。

1.5 微生物計數(shù)檢查法驗證試驗

采用黑曲霉、白色念珠菌進行酵母菌和霉菌總數(shù)計數(shù)檢查法驗證，采用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)5 d。采用黑曲霉、白色念珠菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌進行需氧菌總數(shù)計數(shù)檢查法驗證，供試品組和含黑曲霉、念珠菌的平皿傾倒胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)5 d，含銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的平皿傾倒胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)3 d[5]。

1.5.1 常規(guī)法 酒精棉球消毒處理科洗劑供試品（20180710），pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成1:10 供試液。稀釋劑組：取10 mL pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液置入平皿中，制備兩個平皿傾倒對應(yīng)的培養(yǎng)基。菌液組：取9.9 mL pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液加入0.1 mL 各試驗菌，含菌量50～100 cfu/mL，取1 mL 置平皿中，各試驗菌制備2 個平皿，傾倒對應(yīng)的培養(yǎng)基。供試品組：取10 mL 供試液置平皿中制備兩2 個平皿。試驗組：取9.9 mL 供試液加入0.1 mL 各試驗菌，含菌量50～100 cfu/mL，取1 mL 置平皿中，各試驗菌制備2 個平皿，傾倒對應(yīng)的培養(yǎng)基。

1.5.2 供試液稀釋法 酒精棉球消毒處理科洗劑供試品（20180710），pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成1:10供試液，剩余操作同“常規(guī)法”[6]。

1.5.3 薄膜過濾法 菌液組：用100 mL pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗 3 次，最后一次時加入各試驗菌，含菌量50～100 cfu/mL，將集菌培養(yǎng)器打開，取膜，再將濾膜菌貼于對應(yīng)的平板培養(yǎng)基上。供試品組：取10 mL 供試液加入KSF 220 集菌培養(yǎng)器，100 mL pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3 次，將集菌培養(yǎng)器打開，取膜，再將濾膜菌貼于對應(yīng)的平板培養(yǎng)基上[7]。試驗組：取10 mL 供試液加入KSF 220 集菌培養(yǎng)器，100 mL pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3 次，最后一次時加入各試驗菌，含菌量50～100 cfu/mL，將集菌培養(yǎng)器打開，取膜，再將濾膜菌貼于對應(yīng)的平板培養(yǎng)基上[8]。

2 結(jié)果

2.1 控制菌檢查驗證

2.1.1 銅綠假單胞菌檢查驗證 試驗組：取1 mL 銅綠假單胞菌菌液和10 mL 1:10 供試液接種到200 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)18 h，取培養(yǎng)物接種到溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)18 h。陰性對照組：將10 mL 稀釋劑加入200 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，操作同試驗組。

2.1.2 金黃色葡萄球菌檢查驗證 試驗組：1 mL 金黃色葡萄球菌菌液和10 mL 1:10 供試液接種到200 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)18 h，取培養(yǎng)物接種到甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基。陰性對照組：將10 mL 稀釋劑加入200 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，操作同試驗組[9-10]。

2.1.3 控制菌檢查驗證結(jié)果 銅綠假單胞菌的驗證試驗中，試驗組和陽性對照組檢測均有菌落生長，陰性對照組沒有菌落生長；金黃色葡萄球菌的驗證試驗中，試驗組和陽性對照組檢測均有菌落生長，陰性對照組沒有菌落生長，見表1[11-12]。

表1 控制菌檢查驗證結(jié)果

2.2 批傷科黃藥的微生物限度檢查結(jié)果

通過上述微生物限度檢查法驗證檢查3 批傷科黃藥，結(jié)果均符合藥典規(guī)定，見表2。

表2 3 批傷科黃藥的微生物限度檢查結(jié)果

3 討論

結(jié)果“2.2”顯示，本院自制傷科黃藥可用于銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的微生物限度檢查，說明傷科黃藥微生物限度檢查法經(jīng)驗證符合2015 年版中國藥典要求。