熒光定量技術(shù)檢測牛奶中四環(huán)素類藥物殘留準(zhǔn)確性的研究與探討

文/賈 濤 方 芳 鄭君杰 孫志偉 盧春香

（北京市飼料監(jiān)察所）

四環(huán)素類藥物包含四環(huán)素、金霉素、土霉素、強(qiáng)力霉素，為廣譜抗生素，主要用于治療奶牛立克次氏體、衣原體、支原體等致病微生物感染病癥，多為添加在飼料和飲用水中使用或注射使用。奶牛用藥后，四環(huán)素類藥物會殘留在牛奶中，對人類健康造成危害，尤其是對嬰幼兒的身體健康危害更為突出，其危害主要表現(xiàn)在對嬰幼兒的肝臟、腎臟、牙齒與骨骼等方面的影響。因此，牛奶中四環(huán)素類藥物的快速檢測尤為重要，本試驗(yàn)利用熒光定量技術(shù)檢測牛奶中四環(huán)素類藥物殘留，并與儀器法比較，以研究其準(zhǔn)確性。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

四環(huán)素類熒光定量檢測卡。

1.2 儀器

移液器（移液槍）、計(jì)時器、熒光免疫定量分析儀（型號：FQ-S1）。

2 檢測方法

2.1 檢測原理

采用競爭性免疫熒光層析法檢測目標(biāo)物的殘留濃度，熒光標(biāo)記的抗體預(yù)先包被在釋放墊上。當(dāng)待測樣品滴加在加樣區(qū)時，樣品中的目標(biāo)物在毛細(xì)滲移的過程中，與熒光標(biāo)記的特異性單克隆抗體結(jié)合，抑制了抗體與T區(qū)包被抗原的結(jié)合，使T區(qū)熒光減弱，利用免疫熒光定量分析儀讀取T線與C線位置的熒光強(qiáng)度，通過儀器內(nèi)置的標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出樣品中靶標(biāo)物質(zhì)的含量。

2.2 樣品制備

空白樣品：生鮮乳（牛奶），在檢測時提前恢復(fù)至室溫，并充分搖勻樣品（奶樣不能有結(jié)塊、酸味或沉淀等性狀）。

添加樣品：向空白樣品加入四環(huán)素類標(biāo)準(zhǔn)品至所需濃度。

2.3 最低檢測限的測定

取20 份空白生鮮乳樣品，打開鋁箔袋，取所需量的金標(biāo)微孔和試紙條，做好標(biāo)記，并置于桌面上（取出所需微孔和檢測卡，立即密封鋁箔袋，以防受潮）；吸取200 μL樣本液于金標(biāo)微孔中，小心吹打至孔底的紫紅色顆粒完全溶解（注意吹打時動作要輕柔，避免產(chǎn)生氣泡），室溫（25±2）℃孵育3 min；取120 μL金標(biāo)微孔中樣品加入到加樣孔中，并開始計(jì)時，準(zhǔn)確反應(yīng)10 min后，插入熒光定量分析儀讀數(shù)。計(jì)算其平均值，再加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差，即為最低檢測限。

表1 空白樣品添加濃度

表2 空白生鮮乳樣品四環(huán)素類含量測定結(jié)果

2.4 準(zhǔn)確度和精密度的測定

采用3 個批次四環(huán)素類熒光定量快速檢測卡，對添加四環(huán)素類藥物的生鮮乳樣品進(jìn)行測定。樣品添加藥物濃度為對應(yīng)的最低檢測限（Limit of Detection，LOD）和2倍LOD（表1），每個添加濃度做5個平行，計(jì)算樣品添加回收率和批內(nèi)、批間的變異系數(shù)。

2.5 與儀器方法進(jìn)行比較

采用四環(huán)素類熒光定量檢測卡和儀器法，分別對50 份生鮮乳盲樣進(jìn)行測定，比較測定結(jié)果。儀器方法按照GB/T 22990—2008《牛奶和奶粉中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素殘留量的測定液相色譜-紫外檢測法》中所述的檢測方法進(jìn)行操作。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 最低檢測限的測定

取20 份空白生鮮乳樣品，按照四環(huán)素類熒光定量檢測卡的操作說明書方法進(jìn)行檢測，計(jì)算其平均值，再加上3 倍標(biāo)準(zhǔn)差，即為最低檢測限（表2）。

結(jié)果表明，以四環(huán)素為對照物建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出該藥物的最低檢出限為4.93 μg/L，為保障產(chǎn)品的穩(wěn)定性，可認(rèn)為四環(huán)素類熒光定量檢測卡在生鮮乳中的檢測限為5.00 μg/L。

3.2 準(zhǔn)確度和精密度

準(zhǔn)確度是指測定值與真實(shí)值的符合程度，按2.4中的步驟操作，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，所有樣品各添加濃度的回收率均在84.60%～113.94%。各添加濃度的批內(nèi)、批間變異系數(shù)均低于15.00%。

3.3 與儀器方法比較

采用該四環(huán)素類熒光定量檢測卡和儀器法，分別對50 份生鮮乳盲樣進(jìn)行測定，比較測定結(jié)果，以檢測限作為陰、陽性判定值，小于四環(huán)素類熒光定量檢測卡檢測限的檢測結(jié)果記為“-”，儀器結(jié)果記為“ND”，大于四環(huán)素類熒光定量檢測卡檢測限，以實(shí)際檢測值表示（表4）。結(jié)果顯示，二者的符合率為100%。

4 分析與討論

為評價本試驗(yàn)研制的四環(huán)素類免疫熒光定量檢測卡的可靠性，采用空白樣本進(jìn)行回收率試驗(yàn)，分別從檢出限、準(zhǔn)確度、精密度和與儀器方法比較等4 個方面進(jìn)行驗(yàn)證。

4.1 最低檢測限

取20 份空白樣本進(jìn)行檢測，檢測信號值，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得出待測物濃度，計(jì)算各對應(yīng)濃度值的標(biāo)準(zhǔn)差，由平均值加3 倍標(biāo)準(zhǔn)差即為該樣本的最低檢測限。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素類熒光定量檢測卡在生鮮乳中的檢測限為5.00 μg/L。

4.2 精密度與準(zhǔn)確度

選取空白樣本，添加各藥物檢測限濃度標(biāo)準(zhǔn)品并檢測，每個濃度重復(fù)驗(yàn)證10 次，并統(tǒng)計(jì)添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。用3 個批次熒光定量檢測系統(tǒng)，對空白添加樣品進(jìn)行測定，每種樣品的添加濃度為LOD和2LOD，每個添加濃度做5 個平行，計(jì)算樣品的添加回收率和批內(nèi)、批間變異系數(shù)。經(jīng)試驗(yàn)，所有樣品各添加濃度的回收率均在84.60%～113.94%，各添加濃度的批內(nèi)、批間變異系數(shù)均低于15.00%。

表3 準(zhǔn)確度和精密度

表4 與儀器方法比較結(jié)果 單位：μg/L

4.3 與儀器方法進(jìn)行比較

本試驗(yàn)研制的熒光定量檢測卡和儀器法分別對50 份生鮮乳盲樣進(jìn)行測定，比較測定結(jié)果。儀器方法根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定進(jìn)行操作，結(jié)果顯示，通過對盲樣的測定，四環(huán)素類熒光定量檢測卡和儀器法的陽性符合率為100.00%。